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目的:检测分析正常人淋巴细胞和体外EBV转化淋巴母细胞两者宿主细胞差异表达基因,筛选发现EBV诱导淋巴细胞转化的候选关键基因,探讨EBV诱导淋巴细胞转化的分子机制。方法:采集7例健康献血员新鲜外周静脉血,分离出人淋巴细胞,在体外利用EBV诱导淋巴细胞转化建立淋巴母细胞模型,分别保存正常人淋巴细胞与体外EBV转化淋巴母细胞。采用Agilent 4×44K人类全基因组表达谱芯片检测、比较分析正常人淋巴细胞与体外EBV转化淋巴母细胞的宿主细胞差异表达基因,筛选出fold change≥2的基因为表达显著上调基因,fold change≤0.5为表达显著下调基因。采用实时定量PCR验证基因芯片检测结果。结果:1.EBV转化后的淋巴细胞永生化,经传代培养和显微镜下观察,获得体外EBV转化的淋巴母细胞模型。利用LIMMA算法以t test,p〈0.0001筛选差异表达基因,共筛选出2916个明显差异表达Probes,其中上调基因1328个,下调基因1007个,581个Probes在HUGO未映射有基因(含EST65个),系统构建了7例同源正常淋巴细胞(Norm)和体外EBV转化淋巴母细胞(Trans)的宿主细胞差异基因表达谱。Hierarchical Clustering分析显示,差异表达基因能够很好地区分正常淋巴细胞和EBV转化淋巴母细胞。2.差异表达基因的生物信息学分析Gene Ontology分类中BP分析显示,共958个上调基因参与272个BP分类,其中与细胞周期和有丝分裂相关的“M phase”,“cell cycle process”,“cell cycle phase”,“cell cycle”,“mitotic cell cycle”,“M phase of mitotic cell”,“mitosis”,“nuclear division”和“organelle fission”等10个BP分类EASE score最低,均< 5.1E-39。745个下调基因参与403个BP分类,其中与机体免疫与应激相关的“immune response”,“defense response”,“cell activation”,“response to wounding”,“leukocyte activation”,“positive regulation of biological process”,“inflammatory response”,“regulation of cell activation”,“regulation of cell proliferation”和“regulation of leukocyte activation”等10个BP分类EASE Score得分最低,均<1.7E-9。870个上调基因参与82个MF分类,其中主要涉及基因和蛋白结合活性,如“adenyl nucleotide binding”,“ATP binding”,“nucleoside binding”,“purine nucleoside binding”和“nucleotide binding”的EASE Score得分最低,均<2.6E-12。707个下调基因参与70个MF分类,其中主要涉及分子信号与细胞因子受体结合,如“molecular transducer activity”,“signal transducer activity”,“receptor activity”,“protein binding”和“cytokine binding”等,共有20个EASE Score小于0.001。利用“KEGG Pathway”,“BioCarta”和“Reactome”数据库进行Pathway分析显示,当EASE Score<0.05时,上调基因中321个基因参与25条“KEGG-pathway”,49个基因参与7条“BioCarta-pathway”,340个基因参与12条“Reactome-pathway”。下调基因中256个基因参与12条“KEGG-pathway”, 94个基因参与15条“BioCarta-pathway”,120个基因参与4条“Reactome-pathway”。将上调和下调差异表达基因涉及的生物学功能进行“Functional Annotation Clustering”分析,结果显示上调基因涉及的生物学功能分类聚集为73个集合,其中Enrichment Score分数最高的功能集合主要涉及细胞周期和细胞分裂;下调基因涉及的生物学功能分类聚集为71个集合,Enrichment Score分数最高的功能集合主要涉及细胞凋亡。利用STRING , GENERANK , PATHWAY及GO分类等生物信息学软件综合分析差异表达基因,并按照基因的权重度排序,分选出排序前100位差异表达基因,其中上、下调基因各50个。对此100个基因进行生物学功能分析及预测,上调基因IGF1, GOT2, GOT1, AURKB, CDK2, AURKA, BRCA1, PLK1, KIF20A, KIF18B等主要参与“cell cycle”,“mitosis”,“protein biosynthesis”,“chromosomesegregation”等生物学过程;上调基因E2F1, PTPN11, PIK3R3, PLCG2,下调基因FOS, PXN, PRKCQ, FYN, ZAP70, PROK2, FCN1, HCK等则与肿瘤相关信号通路密切相关,如“P53 pathway”,“Angiogenesis”,“VEGF signaling pathway”,“FGF signaling pathway”,“IGF pathway-protein kinase B signaling cascade”等;下调基因CD3G, CD3D, CD247, S100A8, CD4, GZMA, ITK, CLU, GZMH, GZMK等主要与细胞凋亡、机体免疫调节、应激等生物学过程有关,如“apotosis”,“T/B cell activation”,“immune system process”,“response to stimulus”等。其中部分基因如E2F1, PLK1, PTPN11, FOS, IGF1, CDK2等参与多种生物学行为。3.综合信号通路、基因生物学分类、基因间相互作用分析与预测结果,提示EBV可上调宿主细胞E2F1, PLK1, BIRC5等调控细胞周期及细胞凋亡;上调宿主细胞PTPN11等促进肿瘤血管生成与分化;下调宿主细胞FYN等降低宿主细胞免疫功能。4.实时定量PCR检测结果显示:经内参校正后,与正常人淋巴细胞相比,E2F1, PTPN11, PLK1, BIRC5转录水平在EBV转化淋巴母细胞表达上调;FYN转录水平在转化淋巴母细胞表达下调,结果与基因芯片检测结果一致。结论:1.首次构建了正常人淋巴细胞和体外EBV转化淋巴母细胞的差异基因表达谱,首次发现正常淋巴细胞和转化淋巴母细胞的宿主细胞基因表达模式存在明显差异。2.表明EBV转化淋巴细胞是一个多基因参与,多通路涉及、病毒基因与宿主基因相互作用的过程。推测EBV主要通过促进细胞周期和阻碍宿主免疫功能诱导淋巴细胞转化。3.推测E2F1, PLK1, PTPN11, BIRC5, FYN是EBV诱导淋巴细胞转化的关键分子,其中E2F1可能在细胞周期、细胞凋亡、端粒末端转移酶活性等途径中具有中枢作用。
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