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高温蛋白酶Pgsey及解旋酶Htc16特征的初步研究

作　者: 廖艳江
导　师: 林连兵
学　校: 昆明理工大学
专　业: 微生物学
关键词: 高温蛋白酶纯化性质解旋酶生物信息学分析
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

高温蛋白酶因其反应温度高、热稳定性好而在工业生产中被广泛应用。本文从来自云南腾冲热海热泉水样,分离得到一株产高温蛋白酶的菌株GSEY01.该菌株在2%酪蛋白琼脂固体培养基上能产生明显的蛋白水解圈,其水解圈直径/菌落直径比为0.6。该菌株最适生长温度为60℃,经16S rRNA基因序列分析表明,该菌株为土芽孢杆菌属(Geobacillus)的嗜热菌株。该菌株所产高温蛋白酶Pgsey可以通过超滤浓缩,硫酸铵分级沉淀和强阴离子交换层析获得纯酶。此高温蛋白酶分子量约为42 kDa,最适催化温度为80℃,最适催化pH值为7.5,Mg2+能增强该酶活力,Fe3+、Cd2+、Ni2+对其活性则有抑制作用。PMSF对该酶影响较小,EDTA和SDS则对其有强烈的抑制作用,蛋白酶在98℃下处理30min仍然有17%左右的剩余活性,此高温蛋白酶和其他土芽孢杆菌所产蛋白酶有较大差异,可以应用于相关的高温催化环境。解旋酶是马达蛋白质,使用NTP水解产生的自由能催化双链核酸分子的解链。解旋酶几乎参与所有的核苷酸代谢过程,如复制、重组、修复、转录、翻译、剪接、mRNA编辑、染色体重建、转运和降解等。本文根据高温菌解旋酶的保守序列设计引物,对高温菌Thermus TC16菌株的解旋酶基因进行扩增、测序及序列分析。Thermus TC16菌株的解旋酶含444个氨基酸,与Thermus属菌株的解旋酶基因相似性约为84%,对其进行保守结构域分析表明Thermus TC16菌株的解旋酶Htc16属于解旋酶DnaB超家族,有五个motif,其中包括walker A motif和Walker B motif,同源建模分析表明其与模型2q6aA相似。将该解旋酶基因连接到表达载体pET-28a中,转化BL21(DE3)感受态细胞,得到表达菌株BL21/pET28a-htc16,此解旋酶重组蛋白在37℃获得表达,重组蛋白分子量约53 kDa.1mM IPTG 37℃诱导8h,表达量达到最大,为包涵体表达。

全文目录

摘要 4-5Abstract 5-11图表清单 11-13第一章序言 13-33 1.1 嗜热菌 13-15 1.2 芽孢杆菌中的嗜热类群 15-16 1.3 耐高温蛋白酶简介 16-19 1.4 解旋酶简介 19-31 1.4.1 解旋酶的分类 20-22 1.4.2 解旋酶的结构和功能 22-24 1.4.3 解旋酶和RecA折叠 24-25 1.4.4 解旋酶作用机制 25-30 1.4.5 解旋酶的应用 30-31 1.5 耐热蛋白的热稳定性分析 31 1.6 研究的目的和意义 31-33第二章高温蛋白酶Pgsey的初步研究 33-46 2.1 材料与方法 33-40 2.1.1 培养基 33 2.1.2 分离及筛选产蛋白酶的菌株 33 2.1.3 测定产蛋白酶菌株的生长温度范围 33-34 2.1.4 感受态细胞的制作 34 2.1.5 扩增及测序产蛋白酶菌株的16S rDNA基因 34-36 2.1.6 产蛋白酶菌株系统进化树的构建与分析 36-37 2.1.7 酶活力的测定方法 37-38 2.1.8 分离与纯化蛋白酶 38-39 2.1.9 SDS-PAGE电泳检测 39 2.1.10 蛋白酶最适催化温度的测定 39 2.1.11 蛋白酶最适催化pH的测定 39-40 2.1.12 金属离子对蛋白酶活性的影响 40 2.1.13 酶抑制剂和有机溶剂对酶活性的影响 40 2.2 实验结果 40-44 2.2.1 产酶菌株GSEY01生长特性 40 2.2.2 产酶菌株的系统进化分析 40-41 2.2.3 蛋白酶Pgsey的分离与纯化 41-42 2.2.5 蛋白酶Pgsey最适温度和pH 42-43 2.2.6 金属离子对蛋白酶Pgsey活性的影响 43-44 2.2.7 酶抑制剂和有机溶剂对蛋白酶Pgsey活性的影响 44 2.3 讨论 44-46第三章高温菌Thermus TC16解旋酶基因克隆及其生物信息学分析 46-64 3.1 材料与方法 46 3.1.1 细菌、质粒和引物 46 3.1.2 培养基 46 3.2 方法 46-52 3.2.1 高温菌Thermus TC16的培养 46-47 3.2.2 高温菌Thermus TC16基因组的提取 47 3.2.3 引物设计 47 3.2.4 PCR扩增高温菌Thermus TC16解旋酶基因 47-48 3.2.5 PCR产物的胶回收 48 3.2.6 TC16解旋酶克隆质粒的构建 48-49 3.2.7 菌落PCR检测阳性克隆 49-50 3.2.8 BLAST序列比对 50 3.2.9 分子进化分析 50-51 3.2.10 蛋白质结构和功能预测分析 51-52 3.2.11 模体(motif)分析 52 3.2.12 Swiss-Model Workspace:同源建模服务器分析 52 3.3 结果 52-62 3.3.1 Thermus TC16的培养及其基因组的提取 52-53 3.3.2 PCR扩增高温菌TC16解旋酶基因 53-54 3.3.3 测序结果及分析 54-56 3.3.4 解旋酶Htc16蛋白进化进化分析 56-59 3.3.5 保守序列熵值分析 59-61 3.3.6 同源建模结果 61-62 3.4 讨论 62-64第四章解旋酶Htc16重组蛋白的初步表达 64-75 4.1 材料 64 4.1.1 细菌和质粒 64 4.1.2 培养基 64 4.2 方法 64-71 4.2.1 栖热菌TC16的培养及其基因组的提取 64-65 4.2.2 引物设计与合成 65 4.2.3 PCR扩增高温菌TC16解旋酶基因 65-66 4.2.4 PCR产物的胶回收 66 4.2.5 PCR产物双酶切 66 4.2.6 pET 28a质粒双酶切 66-67 4.2.7 连接 67-68 4.2.8 重组质粒转化E.coli DH5a 68 4.2.9 双酶切鉴定阳性克隆 68-69 4.2.10 重组质粒转化E.coli BL21(DE3) 69 4.2.11 解旋酶Htc16重组蛋白的表达 69-70 4.2.12 表达蛋白可溶性分析 70 4.2.13 SDS-PAGE分析蛋白分子量 70-71 4.3 结果 71-73 4.3.1 PCR扩增高温菌TC16解旋酶基因 71 4.3.2 pET28a-htc16表达质粒的构建 71-72 4.3.3 Htc16重组蛋白的表达 72-73 4.4 讨论 73-75第五章总结与展望 75-77 5.1 总结 75-76 5.2 展望 76-77致谢 77-78参考文献 78-83附录A 攻读硕士期间发表论文目录 83-84附录B 试验常用药品及仪器 84-90 B.1 主要培养基配方 84-85 B.2 主要溶液及其配制 85-88 B.3 主要仪器 88-89 B.4 试剂及酶制品 89-90

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