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红曲霉洛伐他汀生物合成相关基因克隆与分析

作　者: 刘畅
导　师: 葛锋
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 洛伐他汀基因克隆生物信息学超表达
分类号: TQ927
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

红曲霉是一种丝状子囊菌,是我国重要的微生物资源,在食品和酿造工业中的应用已有上千年的历史。目前,以红曲霉固态发酵制成的红曲(米)已被广泛应用于食品添加剂和保健食品的生产中,不仅在中国、韩国、日本、东南亚等传统市场上热哨,而且日益被美国和欧洲市场所接受。红曲霉发酵产物具有显著的医疗效果和食用安全性。尤其因重要的降脂因子洛伐他汀等活性物质在红曲中的发现,促使国内外众多学者对红曲霉的研究始终热度不减,并且研究方向也逐渐深入到红曲特有活性代谢产物的药理机制、生物合成途径相关分子机理及代谢调控的研究。随着红曲霉洛伐他汀生物合成酶基因结构与功能研究的不断深入,采用基因工程手段来提高洛伐他汀产率将会是今后一个重要的研究方向。同时,通过表达基因,纯化蛋白,体外模拟实验等手段进一步研究相关酶的结构与功能以及相互之间的作用方式有利于更加透彻理解洛伐他汀的生物合成过程,从而指导相关基因的分子操作,从根本上提高红曲霉菌株生产洛伐他汀的能力。目前,用来生产红曲的红曲霉菌种大都是紫色红曲霉M. purpureus)。本研究应用同源法首次从紫色红曲霉基因组扩增出MokH, MokF和MplaeA三个基因的全长序列,以及大小约lkb的hsp70部分序列。该四个基因可能在不同的层面上影响红曲霉合成洛伐他汀的能力。其中,紫色红曲霉hsp70基因的部分序列与黑曲霉(Aspergillus niger) hsp70基因同源性最高,最大相似度达到90%；紫色红曲霉与丛毛红曲霉的MokH, MokF和MplaeA序列的最大相似度分别为100%,100%,99%,说明该三个基因在红曲霉种间具有极高的保守性。利用一系列生物信息学分析方法对四个基因编码的氨基酸序列进行分析,亚细胞定位分析结果表明MokF和MplaeA位于细胞质,MokH位于细胞核；经疏水性分析得出MokH.MokF和MplaeA都属于亲水蛋白,且MplaeA的亲水性明显高于MokH和MokF;结构域分析表明MokH具有Zn2Cys6双核簇合物的锌指结构DNA结合结构域,MokF属于β-内酰胺酶家族成员,MplaeA是一种精氨酸甲基转移酶；针对紫色红曲霉中的Hsp70、MokH、MokF和MplaeA四种蛋白分别在18中不同种属的真菌中找到与之对应的同源蛋白序列,进行多重序列比对,并分别由Hsp70,MplaeA和MokF各自同源蛋白比对结果构建出三个系统发生树。从系统发生树的形状可知红曲霉属(Monascus)与曲霉属(Aspergillus)及青霉属(Penicillium)的亲缘关系较近,与阿耶罗菌属(Ajellomyces)亲缘关系较远。并且,通过比较MokF和MplaeA同源蛋白三维构象的预测结果,发现亲缘关系越近,蛋白三维结构的相似度越高,反之越低。利用分子生物学技术构建MokH的组成型真菌表达载体pCAMBIA1300M-MokH,并通过CaCl2冻融法将该植物表达载体转入农杆菌菌株LBA4404和EHA 105中。对根癌农杆菌介导紫色红曲霉的转化体系进行了初步研究,包括通过紫色红曲霉对潮霉素敏感性实验以及头孢霉素抑制根癌农杆菌生长实验得出两种抗生素用于筛选阶段较适宜的浓度分别为40μg/mL和300μg/mL或400μg/mL;采用米粉,察氏、PDA三种培养基培养紫色红曲霉,观察并描述了菌体的生长状态。

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摘要 4-6ABSTRACT 6-8目录 8-11插图和附表清单 11-14第一章文献综述 14-29 1.1 红曲霉聚酮类代谢产物的生物合成 14-20 1.1.1 红曲色素的生物合成 14-15 1.1.2 红曲桔霉素的生物合成 15-18 1.1.3 红曲洛伐他汀的生物合成 18-20 1.2 红曲中"一毒一宝"的代谢调控 20-26 1.2.1 红曲桔霉素的控制对策 20-22 1.2.2 红曲洛伐他汀的高产策略 22-26 1.3 基因超表达技术在丝状真菌中的应用 26-27 1.4 根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展 27 1.5 本研究目的、内容和意义 27-29第二章紫色红曲霉洛伐他汀合成相关基因的克隆与分析 29-64 2.1 前言 29 2.2 材料 29-30 2.2.1 菌株和载体 29 2.2.2 主要试剂 29-30 2.2.3 缓冲液和培养基配方 30 2.3 方法 30-33 2.3.1 红曲霉基因组DNA的提取 30 2.3.2 PCR反应 30-32 2.3.3 T-A克隆 32 2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的热刺激转化 32-33 2.3.5 琼脂糖凝胶电泳 33 2.3.6 序列分析 33 2.4 结果与分析 33-62 2.4.1 基因序列的扩增 33-41 2.4.2 生物信息学分析 41-62 2.5 讨论 62-64第三章 MokH基因超表达载体的构建 64-72 3.1 前言 64 3.2 材料 64-65 3.2.1 菌株和载体 64-65 3.2.2 主要试剂 65 3.2.3 缓冲液和培养基配 65 3.3 方法 65-68 3.3.1 SDS碱裂解法提取并纯化质粒 65-66 3.3.2 酶切反应 66 3.3.3 胶回收 66-67 3.3.4 DNA连接反应 67 3.3.5 大肠杆菌感受态细胞的热刺激转化 67-68 3.4 结果与分析 68-71 3.5 讨论 71-72第四章农杆菌介导紫色红曲霉遗传转化的初步研究 72-79 4.1 前言 72 4.2 材料 72-73 4.2.1 菌株和载体 72 4.2.2 主要试剂 72 4.2.3 缓冲液和培养基配方 72-73 4.3 方法 73-74 4.3.1 SDS碱裂解法提取并纯化质粒 73 4.3.2 制备农杆菌感受态细胞 73 4.3.3 CaCl_2冻融法转化农杆菌感受态细胞 73-74 4.3.4 PCR反应 74 4.3.5 潮霉素敏感性测定 74 4.3.6 头孢霉素抑菌实验 74 4.3.7 培养基实验 74 4.4 结果与分析 74-77 4.4.1 真菌超表达载体pCAMBIA1300M-MokH转化根癌农杆菌 74-75 4.4.2 紫色红曲霉对潮霉素敏感性实验 75-76 4.4.3 头孢霉素抑制农杆菌生长实验 76 4.4.4 紫色红曲霉在三种不同培养基上的生长状况 76-77 4.5 讨论 77-79第五章结论 79-81致谢 81-82参考文献 82-89附录A 攻读硕士期间发表论文目录 89

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