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人sBAFF-DT388融合蛋白在大肠杆菌表达及其活性研究

作　者: 朱月婷
导　师: 赵跃然
学　校: 济南大学
专　业: 免疫学
关键词: B淋巴细胞刺激因子白喉类毒素重组融合蛋白质类大肠杆菌表达纯化活性测定
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

免疫毒素(Immunotoxins,IT),又被称之为生物导弹,其具有专门选择性的破坏某一特异性标记细胞功能的一类融合蛋白,它是通过通过化学交联的方式将具有高度特异性的单克隆抗体与具有强大杀伤作用的毒素分子构建而成。免疫毒素利用肿瘤细胞上导向分子的受体与细胞结合,进入细胞后由毒素发挥蛋白质合成抑制作用,最终能够导致靶细胞的死亡,其具备了特异性的识别的功能和毒素杀伤的功能效应,对传统的治疗肿瘤化疗、放疗的缺陷进行了弥补。B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulating factor,BAFF)属肿瘤坏死因子家族新成员,因其在B细胞发育及自身免疫病中起重要作用而倍受关注。BAFF通过与其受体结合广泛参与T、B淋巴细胞增殖和功能调节,发挥其生物学效应。BAFF的缺乏可导致免疫功能低下,过表达则与多种自身免疫性疾病的发生和发展密切相关。目的为探讨人sBAFF-DT388在B细胞恶性肿瘤及自身免疫性疾病中的治疗作用,我们进行了人sBAFF-DT388融合蛋白表达载体的构建、重组蛋白的分离纯化及其生物学活性的初步研究。方法1.根据优化合成的hsBAFF-DT388基因序列设计引物,经PCR扩增将目的基因片段插入到pMD19-T克隆载体,菌落PCR、限制性内切酶酶切及DNA测序鉴定阳性克隆。2.重组克隆载体经NdeⅠ、XhoⅠ双酶切后,琼脂糖凝胶电泳分离目的基因,将其插入表达载体pColdⅡ相应酶切位点,转化BL21感受态菌株,菌落PCR鉴定重组表达载体。3.挑取单克隆菌落扩增培养至对数生长期,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析和Western blot鉴定重组蛋白。4.Ni2+-NTA层析柱纯化重组蛋白,经透析后,SDS-PAGE检测重组蛋白。5.利用PE荧光素标记重组蛋白,检测其与受体结合能力。6.细胞毒性实验检测重组蛋白对BAFF-R(+)B细胞株Hmy2.CIR细胞的杀伤作用。采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。结果1.成功构建了人sBAFF-DT388重组质粒pMD-hsBAFF-DT388,测序结果显示克隆目的基因序列与优化后的人sBAFF-DT388基因序列完全一致。2.阳性重组表达载体转化BL21感受态菌株后经IPTG诱导,行SDS-PAGE分析结果显示诱导后的阳性重组菌株在58.4KD处出现明显蛋白条带,符合目的蛋白大小,图像扫描分析显示获得的目的蛋白约占菌体总蛋白的40%。Western blot结果显示重组蛋白能与抗BAFF多克隆抗体和抗His-Tag多克隆抗体均能发生特异反应,表明获得的重组蛋白为特异性hsBAFF-DT388融合蛋白。3.重组蛋白经Ni2+-NTA层析柱纯化,经凝胶图像扫描分析,hsBAFF-DT388重组蛋白纯度达90%以上。4.荧光素标记重组蛋白后在倒置荧光显微镜下可观察到BAFF-R(+)Hmy2.CIR细胞有较强红色荧光出现,而阴性对照组BAFF-R(-)U937细胞则未见荧光,表明重组蛋白与BAFF-R(+)Hmy2.CIR细胞表面受体具有特异性结合能力。5.细胞毒实验检测重组蛋白对BAFF-R(+)B细胞株Hmy2.CIR细胞的杀伤作用,结果显示重组蛋白对其具有较强的抑制效应,且抑制效应具有剂量依赖关系,即随着重组蛋白浓度的增加抑制效应越强(P<0.05)。而不同浓度的重组蛋白对阴性对照组BAFF-R(-) U937细胞抑制效应无统计学差异(P>0.05)。结论利用PCR技术成功克隆了人sBAFF-DT388目的基因,序列分析显示与优化后的基因序列一完全致;重组技术构建pcoldⅡ-hsBAFF-DT388的原核表达载体,转化BL21感受态菌株后获得稳定表达的工程菌株;初步探索优化了重组pcoldⅡ-hsBAFF-DT388的表达条件、包涵体提取步骤及蛋白初步纯化工艺;获得了具有靶向B细胞活性的重组蛋白,为其在B细胞恶性肿瘤及自身免疫性疾病治疗中的应用研究奠定了基础。

全文目录

摘要  5-8
英文摘要  8-11
主要符号表  11-13
第一部分人sBAFF-DT388 基因克隆及序列分析  13-31
  前言  13-14
  材料与方法  14-24
  结果  24-29
  讨论  29-30
  结论  30-31
第二部分人sBAFF-DT388 基因在大肠杆菌中的表达及重组蛋白的鉴定  31-52
  前言  31
  材料与方法  31-47
  结果  47-51
  讨论  51
  结论  51-52
第三部分人sBAFF-DT388 重组蛋白的生物学活性测定  52-62
  前言  52
  材料与方法  52-57
  结果  57-59
  讨论  59-61
  结论  61-62
参考文献  62-66
文献综述  66-73
  参考文献  71-73
攻读硕士学位期间取得的研究成果  73-74
致谢  74

人sBAFF-DT388融合蛋白在大肠杆菌表达及其活性研究

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