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猪瘟兔化弱毒疫苗效检替代方法及疫苗中牛病毒性腹泻病毒检测方法的研究

作　者: 姚华伟
导　师: 黄伟；王琴
学　校: 西南大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪瘟兔化弱毒疫苗牛病毒性腹泻病毒效价检测荧光定量PCR 直接免疫荧光
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的猪的高度致死性、接触性传染病,是OIE规定的必须通报的A类动物传染病之一。猪瘟兔化弱毒(Hog Cholera Lapinized Virus, HCLV)是世界公认的最安全、免疫效果最好的猪瘟疫苗毒株,也是我国唯一使用的猪瘟疫苗毒株。CSFV只感染猪。HCLV只引起家兔发生热反应,在敏感的细胞培养物生长繁殖后,无CPE出现。家兔热反应是HCLV病毒效价测定和CSF疫苗成品效力检验的主要方法。HCLV所致的家兔热反应存在个体差异大和测定时间长(3-9天)等问题。此外,现有荧光抗体技术不适用于成品和半成品中的牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus, BVDV)污染的检测。据报道,猪瘟疫苗中污染BVDV后,HCLV有效免疫原量减少,致使临床使用后发生猪瘟免疫失败。同时,BVDV可引起猪只发生类似猪瘟的疫病,导致疫苗接种猪发病或死亡。因此,研究可替代兔热法的HCLV效价测定和效力检验方法,以及能够用于猪瘟疫苗生产中半成品和成品BVDV污染检测的新技术具有重大经济价值和社会意义。本文报道用于HCLV的效价和效力检测的荧光定量PCR (Real time Fluorogenetic (?) PCR, FQ-PCR)、WH303单抗荧光TCID50 (McAb-FITCID50)及检测猪瘟疫苗中BVDV污染的FQ-PCR试剂盒的研制结果。1、HCLV FQ-PCR和BVDV FQ-PCR根据GenBank公布的CSFV全序列、BVDV全序列和绵羊边界病病毒(Border Disease Virus, BDV)全序列综合比对分析结果,分别设计针对HCLV和BVDV的特异性TaqMan-MGB荧光探针和引物,构建阳性标准品,建立起HCLV和BVDV的特异的绝对定量FQ-PCR试剂盒。结果显示,HCLV FQ-PCR检测灵敏度为4.35个核酸拷贝量,CT值与模板之间相关系数为0.9998,扩增效率为101.14%,40个质控样本保存6个月,CT值变异系数为1.1～4.0%; BVDV FQ-PCR方法CT值与模板之间相关系数为0.9978,扩增效率为95.68%,20个质控样本保存6个月,CT值变异系数为1.1-2.4%。对CSFV、BVDV、BDV、PRRSV、FMDV等9种猪病相关病原的检测结果显示,HCLV FQ-PCR和BVDV FQ-PCR试剂盒均只能在HCLV或BVDV样品出现阳性反应。结果表明, HCLV FQ-PCR和BVDV FQ-PCR试剂盒均具有高度特异性、敏感性和稳定性。2、McAb-FITCID50法CSFV单抗WH303杂交瘤细胞来自英国兽医实验室(Veterinary Laboratories Agency, VLA)。采用FITC标记WH303 McAb,对细胞接种HCLV后进行原位直接免疫荧光检测,可测定HCLV TCID50,从而实现病毒含量的定量检测。实验结果显示,McAb-FITCID50法特异性好,与BVDV、BDV、PRRSV、FMDV等9种病毒无交叉反应。3、猪瘟疫苗半成品效价应用检测来自4个厂家17个批次的34份猪瘟兔化弱毒疫苗半成品稀释100万倍后,同时采用兔热反应、HCLV FQ-PCR和McAb-FITCID50测定,结果是,两只兔子均无热反应(不合格)样品共11份,FQ-PCR CT值为21.15～27.30,对应病毒核酸量为8.80×102copy/μL～6.52×104copy/μL, McAb-FITCID50值为10-0.6/0.1mL～10-2.5/0.1mL;两只兔子呈现一只定性热一只无热反应,或者一只呈现轻热反应一只无热反应,或者两只都呈现轻热反应(可疑)样品共12份,CT值为17.47～23.70,病毒含量为1.10×104copy/μL～8.55×105copy/μL,McAb-FITCID50值为10-2.4/0.1mL-10-3.76/0.1mL；两只兔子都呈现定型热或者一只呈现定型热一只呈现轻热反应(合格品)样品共11份,CT值为17.10～20.81,病毒含量为8.27×104copy/μL～1.11×106copy/μL,McAb-FITCID50值为10-2.88/0.1mL～10-4.54/0.1mL。结果显示,HCLV FQ-PCR和McAb-FITCID50测定结果与家兔热反应测定结果存在良好的相关性,可以用于猪瘟疫苗半成品中HCLV效价检测。4、猪瘟疫苗半成品及成品中BVDV污染检测来自不同厂家不同批次的猪瘟疫苗半成品58份及成品36份,BVDV FQ-PCR检测阳性率分别为20.7%和22.2%。检测结果提示,我国猪瘟疫苗中BVDV污染较为严重。研究结果表明FQ(?)-FUTCID50试剂盒测定半成品中HCLV效价、检验成品效力和BVDV污染情况,显示出高度的灵敏度,很好的特异性和重复性,可以用于替代HCLV家兔热反应方法。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
第1章文献综述  11-23
  1. 猪瘟病毒病原学概述  11-12
  2. 猪瘟流行病学  12-14
  3. 猪瘟疫苗研究进展  14-20
  4. 实时荧光定量PCR研究进展  20-23
第2章引言  23-27
  1. 研究目的和意义  23-24
  2. 研究内容和技术路线  24-27
    2.1 研究内容  24-25
    2.2 技术路线  25-27
第3章猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量PCR检测试剂盒的研制  27-51
  1. 材料  28-29
  2. 方法  29-37
  3. 结果  37-48
  4. 讨论  48-49
  5. 小结  49-51
第4章猪瘟单克隆抗体直接免疫荧光检测方法的建立  51-61
  1. 材料  51-52
  2. 方法  52-56
  3. 结果  56-59
  4. 讨论  59-60
  5. 小结  60-61
第5章 FQ-PCR及免疫荧光法测定猪瘟疫苗效价  61-69
  1. 材料  62-63
  2. 方法  63-64
  3. 结果  64-67
  4. 讨论  67-68
  5. 小结  68-69
第6章 BVDV FQ-PCR试剂盒的研制及在猪瘟疫苗污染检测上的应用  69-89
  1. 材料  69-70
  2. 方法  70-75
  3. 结果  75-86
  4. 讨论  86-87
  5. 小结  87-89
第7章结论及创新点  89-91
  1. 结论  89
  2. 创新点  89-91
参考文献  91-99
附录  99-101
致谢  101-103
发表的论文  103

猪瘟兔化弱毒疫苗效检替代方法及疫苗中牛病毒性腹泻病毒检测方法的研究

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