学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

鸭ADSL与PurH基因序列特征及表达与肌肉肌苷酸（IMP）含量的相关性分析

作　者: 徐善金
导　师: 杜文兴
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 鸭 ADSL基因 PurH基因 荧光定量PCR 肌苷酸 高效液相色谱法
分类号: S834
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 8次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


肌苷酸(IMP, inosine monophosphate acid)是畜禽肉中重要的风味物质,目前国际上把IMP含量作为衡量肉质鲜味的一项重要指标。在动物体内,IMP从头合成共涉及十步反应,其中腺苷琥珀酸裂解酶(ADSL, adenylosuccinate lyase)是催化第八步反应的酶,也是合成IMP过程中的关键酶之一。PurH(ATIC)是具有氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶(AICARTfase)(EC 2.1.2.3)和次黄嘌呤核苷酸环水解酶(IMPCH)(EC3.5.4.10)催化活性的双功能酶,催化肌苷酸(IMP)合成的最后两步反应-第九步与第十步,对IMP的合成具有关键的调控作用。克隆连城白鸭、金陵白鸭以及樱桃谷鸭ADSL和PurH基因的完整编码区(CDS),进行核酸和蛋白序列分析,研究这两个基因在各品种肌肉组织mRNAs表达水平；分别对三个品种鸭肌肉组织这两个基因mRNAs表达水平与肌肉组织肌苷酸(IMP,inosine monophosphate acid)含量进行相关性分析。为揭示我国优良地方鸭种的风味基因结构、研究其生物学功能以及与重要风味物质的关系奠定了理论基础。1 ADSL和PurH基因的克隆测序通过对多个物种ADSL和PurH基因进行同源性比对,寻找高度保守区并在该区域设计先设计一对引物,然后根据已扩片段再设计两对引物扩增两端序列,借助RT-PCR和染色体步移技术获得三个品种鸭ADSL和PurH基因部分cDNA序列,它们包含了完整的编码区,CDS长度分别为1380 bp和1782 bp。2 ADSL和PurH蛋白的生物信息学分析运用生物信息学方法分析三个品种鸭ADSL和PurH基因编码区序列、蛋白结构和进化关系。预测出ADSL和PurH分别编码459和593个氨基酸残基。ADSL理化性质表明该蛋白为一偏碱性蛋白,有较为强烈的信号肽和细胞内跨膜结构,蛋白二级结构主要由α螺旋构成,另外含有少量p折叠、p转角及无规则卷曲结构。该蛋白含有腺苷酸基琥珀酸裂解酶蛋白家族的典型结构域PRK08937、且和鸡的蛋白结构域一致。PurH也为一偏碱性蛋白,有不太明显的信号肽,但含有跨膜结构,蛋白二级结构主要由α螺旋与β折叠构成,另外还包含一些卷曲结构和β转角结构。PurH和其它物种该酶一样含有PurH蛋白家族的MGS-like superfamily,AICARFT_IMPCHas superfamily典型结构域。同源性分析发现,鸭与鸡的亲缘关系最近,ADSL与其它物种同源性都在75%以上,ATIC与其它物种的同源性也都在79%以上,表明这两个基因在动物的发育进化中是比较保守的。3 Real-time PCR分析ADSL和PurH基因在肌肉组织中的相对表达采用RT-PCR技术,分析了三个品种鸭ADSL和PurH基因在肌肉组织中的相对表达水平,结果表明：ADSL和PurH基因在三个品种鸭的胸肌和腿肌中均表达,连城白鸭、金陵白鸭及樱桃谷鸭之间的表达量差异极显著(P<0.01)；这三个品种中,雌性表达量要极显著高于雄性(P<0.01)。各个体胸肌ADSL基因表达量要显著高于腿肌(P<0.05),樱桃谷鸭除外(P>0.05)；连城白鸭各个体胸肌PurH基因表达量要显著高于腿肌(P<0.05),而金陵白鸭和樱桃谷鸭各个体胸肌与腿肌PurH基因表达量差异不显著(P>0.05)。4鸭肌肉组织肌苷酸含量的测定采用高效液相色谱法测定了三个品种鸭胸肌和腿肌中IMP的含量,结果表明：不同品种之间IMP含量差异极显著(P<0.01),以连城白鸭最高、金陵白鸭次之、樱桃谷鸭最低；同一品种内雌性显著高于雄性(P<0.05)；各个体胸肌显著高于腿肌(P<0.05)。5鸭肌肉组织ADSL和PurH基因mRNA表达量与对应组织肌苷酸含量的相关性分析通过对ADSL和PurH基因mRNA表达量与对应组织IMP含量相关性分析,结果表明：ADSL和PurH基因表达量和对应组织IMP含量有着较高的正相关性。不同品种、不同性别及不同组织(樱桃谷鸭除外)ADSL基因表达量与对应组织肌苷酸含量的相关系数R2分别为0.9592,0.9618,0.9577；不同品种、不同性别PurH基因表达量与对应组织肌苷酸含量的相关系数R2分别为0.9609,0.9584,连城白鸭胸肌和腿肌PurH基因表达量与对应肌苷酸含量的相关系数R2为0.8156,金陵白鸭与樱桃谷鸭各个体胸肌与腿肌PurH基因表达量与对应肌苷酸含量无明显相关性。

全文目录


摘要  9-11ABSTRACT  11-14第一篇 文献综述  14-46  第一章 肌苷酸及其相关酶的研究概况  14-32    1 肌苷酸结构与特性  14-15      1.1 肌苷酸分子结构  14      1.2 肌苷酸特性  14-15    2 肌苷酸的代谢  15      2.1 肌苷酸的合成  15      2.2 肌苷酸代谢过程中的酶  15    3 肌苷酸代谢相关的酶以及酶的基因研究  15-24      3.1 谷氨酸胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶(GAPTase)  15-16      3.2 甘氨酰胺核苷酸合成酶-氨基咪唑核苷酸合成酶-甘氨酰胺核苷酸转甲酰基酶(GARS-AIRS-GART)  16-18      3.3 甲酰甘氨脒核苷酸合成酶(purL或purLQS)  18      3.4 氨基咪唑核苷酸羧化酶(purE Ⅱ或purK和purEⅠ)  18-19      3.5 氨基咪唑琥珀基氨甲酰核苷酸(SAICAR)合成酶(purC)  19      3.6 腺苷酸琥珀酸裂解酶(purB或ADSL)  19-20      3.7 氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶(PurHJ)  20-24      3.8 腺嘌呤核苷酸脱氨酶(AMPD)  24    4 肌苷酸检测技术  24-25    5 IMP含量的调控  25    6 肌苷酸研究展望  25-27    参考文献  27-32  第二章 基因的克隆及生物信息学分析  32-46    1 克隆基因的几种常用方法  32-37      1.1 利用已知探针克隆基因  32      1.2 克隆未知序列的基因  32-33        1.2.1 随机引物法克隆未知序列基因  32        1.2.2 差异显示PCR(DD-PCR)  32-33        1.2.3 差减杂交PCR(RDA-PCR)  33      1.3 用特异抗体克隆基因  33      1.4 特异基因的功能克隆  33-34      1.5 染色体步技术  34-35      1.6 EST电子克隆及RACE技术的应用  35-37        1.6.1 EST电子克隆  35-36        1.6.2 RACE技术的原理  36-37          1.6.2.1 3’RACE的获得  36-37          1.6.2.2 5’RACE的获得  37    2 核酸序列分析  37-38      2.1 ORF(Open Reading Frame)分析  37-38      2.2 染色体定位  38      2.3 基因结构分析  38      2.4 基因上游调控区分析  38    3 蛋白质结构分析和功能预测  38-41      3.1 蛋白质氨基酸组成、分子量和等电点分析  39      3.2 疏水性分析  39      3.3 信号肽预测  39-40      3.4 跨膜区预测  40      3.5 亚细胞定位预测  40      3.6 蛋白质功能结构域分析  40-41      3.7 蛋白质多序列比对和分子系统发生分析  41    4 小结  41-42    5 本试验研究目的和意义  42-43    参考文献  43-46第二篇 实验研究  46-94  第三章 鸭ADSL与PurH基因编码区的克隆测序  46-58    1 材料与方法  46-54      1.1 材料  46-48        1.1.1 实验动物与样品采集  46-47        1.1.2 网络资源及软件  47        1.1.3 主要试剂及试剂盒  47        1.1.4 主要仪器  47        1.1.5 主要溶液及其配制  47-48          1.1.5.1 RNA提取试剂配制  47-48          1.1.5.2 琼脂糖电泳试剂配制  48      1.2 方法  48-54        1.2.1 引物设计  48-49        1.2.2 RT-PCR扩增目的区  49-51          1.2.2.1 肌肉组织总RNA抽提  49          1.2.2.2 RNA浓度和纯度检测  49-50          1.2.2.3 RNA完整性检测  50          1.2.2.4 第一链cDNA合成  50-51          1.2.2.5 PCR扩增ORF区  51          1.2.2.6 琼脂糖电泳检测  51          1.2.2.7 琼脂糖电泳检测  51        1.2.3 cDNA克隆测序  51-54          1.2.3.1 目的片断回收和纯化  51-52          1.2.3.2 快速TOP10感受态制备  52          1.2.3.3 连接反应  52          1.2.3.4 转化  52-53          1.2.3.5 菌落筛选  53          1.2.3.6 菌落PCR鉴定  53          1.2.3.7 质粒抽提  53-54          1.2.3.8 测序  54    2 结果与分析  54-55      2.1 鸭ADSL基因CDS区的核酸序列分析  54      2.2 鸭PurH基因CDS区的核酸序列分析  54-55    3 讨论  55-56    4 小结  56-58  第四章 蛋白质序列的生物信息学分析  58-72    1 材料与方法  58-60      1.1 材料  58      1.2 方法  58-60        1.2.1 蛋白质氨基酸组成、分子量和等电点分析  58        1.2.2 蛋白质疏水性分析  58-59        1.2.3 蛋白质信号肽预测  59        1.2.4 跨膜区预测  59        1.2.5 亚细胞定位预测  59        1.2.6 蛋白质功能位点和结构域预测  59-60        1.2.7 蛋白质氨基酸序列间的多重比对和分子系统发生分析  60    2 结果与分析  60-67      2.1 ADSL和PurH蛋白质组成、基本理化性质、疏水性和信号肽分析  60-63      2.2 鸭ADSL和PurH蛋白质功能位点、二级结构以及三级结构预测  63-66      2.3 同源性比较与系统发育树分析  66-67    3 讨论  67-69    4 小结  69-70    参考文献  70-72  第五章 鸭ADSL和PurH基因mRNA在胸肌和腿肌中的表达分析  72-82    1. 材料与方法  72-74      1.1 材料  72-73        1.1.1 试验动物  72        1.1.2 主要试剂  72        1.1.3 主要仪器  72        1.1.4 主要溶液及其配制  72-73      1.2 试验方法  73-74        1.2.1 引物设计  73        1.2.2 总RNA抽提  73        1.2.3 RNA浓度和纯度检测  73        1.2.4 第一链cDNA合成  73        1.2.5 cDNA质量检测  73-74        1.2.6 Real-time PCR  74          1.2.6.1 20 μl反应体系  74          1.2.6.2 反应程序  74          1.2.6.3 数据处理  74    2 结果与分析  74-77      2.1 ADSL基因mRNA表达量分析  74-75      2.2 PurH基因mRNA表达量分析  75-77    3 讨论  77-79      3.1 内参基因的选择  77      3.2 各种RT-PCR方法的比较  77-78      3.3 ADSL和PurH基因mRNA的相对表达分析  78-79    4 小结  79-80    参考文献  80-82  第六章 鸭肌肉肌苷酸含量的测定与分析  82-88    1. 材料与方法  82-83      1.1 材料与试剂  82      1.2 主要溶液配制  82        1.2.1 PH=7.0的50mmol/l硼酸缓冲溶液配制  82        1.2.2 流动相配制  82        1.2.3 IMP标准溶液配制  82      1.3 仪器与设备  82      1.4 样品制备  82-83      1.5 色谱分离条件  83    2. 结果  83-84    3. 讨论  84-85    4 小结  85-87    参考文献  87-88  第七章 鸭ADSL和PurH基因mRNA表达量与肌苷酸含量的相关性分析  88-94    1. 材料  88    2. 结果  88-89      2.1 ADSL基因mRNA表达量与肌肉IMP含量的相关性分析  88-89      2.2 PurH基因mRNA表达量与肌肉IMP含量的相关性分析  89    3. 讨论  89-91    4 小结  91-92    参考文献  92-94全文结论  94-96附录  96-98致谢  98-100攻读硕士期间发表的学术论文  100

相似论文

  1. 草菇采后生理生化及保鲜方法的研究,S646.13
  2. 不同类型稻田非作物生境的节肢动物多样性,S435.112
  3. 奶粉中三聚氰胺分析方法研究及快速测定体系的建立,O657.3
  4. 溶藻弧菌毒力相关基因的检测与保藏方法的研究,S943
  5. 微生物有机肥防治土传棉花黄萎病的效果及对根际微生物影响,S144.1
  6. 新疆紫草细胞的稀土生物学效应及遗传转化,S567.239
  7. 一水肌酸对肉鸭胴体组成、肉品质及宰后肌肉能量代谢的影响研究,S834.5
  8. 鸭源鸡杆菌抗体消长规律研究及抗脂多糖单抗杂交瘤细胞株的建立,S858.32
  9. 生长素对harpin蛋白激发HR的调控机制初步研究,S432.1
  10. 61株鸭源鸡杆菌部分耐药基因及其与耐药性关系的研究,S852.61
  11. 4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯的制备和质量控制的初步研究,TQ463
  12. 二次杀菌南京盐水鸭风味及脂肪氧化的影响分析,TS251.68
  13. 荧光定量PCR方法在土传烟草青枯病生防研究中的应用,S435.72
  14. 大白菜霜霉菌诱导抑制性消减cDNA文库的构建及防御相关基因的表达分析,S436.341
  15. 烟夜蛾气味受体基因和精氨酸激酶基因的克隆与表达分析,S433.4
  16. 棉铃虫与烟夜蛾寄主选择机制的比较研究,S435.622.3
  17. 玉米光周期敏感基因ZmELF4的克隆及功能验证,S513
  18. 不同管理模式稻田节肢动物多样性研究,S511
  19. 苹果Ca2+/H+反向转运体活性及其基因表达特性研究,S661.1
  20. 寒胁迫下佛手差异表达基因的研究,S666.9

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家禽 > 鸭
© 2012 www.xueweilunwen.com