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微生物有机肥防治土传棉花黄萎病的效果及对根际微生物影响

作　者: 郎娇娇
导　师: 沈其荣；胡江
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物营养学
关键词: 棉花黄萎病微生物有机肥根际微生物 DGGE 实时荧光定量PCR
分类号: S144.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

土传棉花黄萎病是棉花产生连作障碍的主要病害之一,是一种典型的土传病害,其病原菌为土壤习居菌大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.(Vd),该病害的防治方法已成为棉花生产的研究热点。目前,生物防治已成为克服土传植物病害的重要途径之一,而利用拮抗菌防治土传棉花黄萎病日益受到国内外的重视。本文利用本实验室已经筛选出的2株高效拮抗土传棉花黄萎病的菌株HJ5和DF14,将其接种于合适的有机肥(OF)载体中进行二次固体发酵,获得了新型微生物有机肥(BIO),以便于给功能性微生物提供合适的保护和营养,使其容易在土壤和植物根系定殖。本研究采用营养钵施肥和土体施肥相结合的施肥方法,证明微生物有机肥能有效控制土传棉花黄萎病的发生和调控根际土壤微生物群落结构。微生物有机肥的施用改变了土壤微生物的区系,细菌的数量大大增加,真菌数量明显减少。在连续三季棉花盆栽试验中,在营养钵中施用1%的微生物有机肥并在大盆钵土体中施用0.5%微生物有机肥的处理(NBIO+TBIO)对土传棉花黄萎病的防治效果均达到95%以上；施用微生物有机肥能够有效地提高棉花的产量,NBIO+TBIO处理的棉花产量是对照的3倍多。仅在营养钵土壤施用微生物有机肥(处理NBIO+TCK)或仅在大盆钵土壤中施用微生物有机肥(处理NCK+TBIO)也能提高防治效果,但以在营养钵和大盆钵中均施用微生物有机肥的效果最好。分子生物学PCR-DGGE方法测定结果显示在连续三季棉花盆钵试验中,与对照比较,处理NBIO+TBIO土壤的细菌群落显著增加,真菌群落大量减少。Real-time PCR分析结果表明施用微生物有机肥能够显著降低连作棉花根际土壤中的大丽轮枝菌的数量。综上所述,本文对微生物有机肥的微生物学和分子生物学特征的研究,揭示了微生物有机肥对棉花黄萎病的生物防治机理,为微生物有机肥的研发和应用提供了理论依据。今后应进一步研究微生物有机肥修复连作障碍土壤的分子生物学基础,揭示土壤功能微生物对植物生长和健康的调控作用。

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摘要 9-10ABSTRACT 10-12第一章文献综述 12-36 1.1 棉花黄萎病概述 12-15 1.1.1 棉花黄萎病的现状 12 1.1.2 黄萎病的致病机理 12-13 1.1.3 黄萎病的防治现状 13-15 1.2 连作障碍对植物生长的影响 15-17 1.2.1 连作障碍产生的原因 15-16 1.2.2 连作障碍对土壤微生物区系的影响 16-17 1.3 土壤微生物多样性的研究方法 17-21 1.3.1 微生物平板培养方法 17-18 1.3.2 Biolog GN方法 18 1.3.3 生物化学方法的代表——脂肪酸甲酯(Fatty Acid Methyl Ester,FAME)谱图分析 18-19 1.3.4 分子生物学方法 19-21 1.4 变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术的应用 21-24 1.4.1 DGGE技术的原理 22 1.4.2 DGGE技术的应用 22-23 1.4.3 DGGE技术的优缺点 23-24 1.4.4 DGGE技术的应用前景及展望 24 1.5 荧光定量PCR(Real-time PCR)技术的应用 24-27 1.5.1 Real-time PCR技术的原理 24-25 1.5.2 Real-time PCR技术的应用 25 1.5.3 Real-time PCR技术的优缺点 25-26 1.5.4 Real-time PCR技术的应用前景及展望 26-27 1.6 试验的研究内容及目的意义 27-28 1.6.1 试验的研究内容 27 1.6.2 试验的目的意义 27-28 参考文献 28-36第二章微生物有机肥的制备及其对棉花黄萎病的防治效果 36-44 2.1 材料与方法 36-38 2.1.1 供试材料 36-37 2.1.2 试验设计 37-38 2.1.3 试验时间 38 2.1.4 发病率统计和样品采集 38 2.1.5 分析与统计 38 2.2 结果与分析 38-40 2.2.1 盆栽试验棉花的发病率及防治效果 38-39 2.2.2 盆栽试验棉花的产量 39-40 2.3 讨论 40-41 2.4 小结 41-42 参考文献 42-44第三章微生物有机肥对棉花不同生育期根际土壤中细菌多样性的影响 44-62 3.1 材料与方法 44-48 3.1.1 供试材料 44 3.1.2 试验设计 44 3.1.3 试验时间 44 3.1.4 土壤样品采集 44-45 3.1.5 土壤总DNA的提取 45 3.1.6 PCR扩增 45 3.1.7 DGGE及DGGE凝胶的分析 45-47 3.1.7.1 实验试剂及配置 45-46 3.1.7.2 变性胶的制备 46 3.1.7.3 电泳 46 3.1.7.4 染色 46-47 3.1.8 DGGE条带测序及分析 47-48 3.1.8.1 PCR产物的纯化 47 3.1.8.2 连接反应 47 3.1.8.3 感受态细胞Escherichia coli DH5α的制备 47 3.1.8.4 转化 47-48 3.1.8.5 阳性克隆的检测 48 3.1.9 分析与统计 48 3.2 结果与分析 48-59 3.2.1 苗期根际细菌群落多样性分析 48-50 3.2.2 现蕾期根际细菌群落多样性分析 50-52 3.2.3 花铃期根际细菌群落多样性分析 52-54 3.2.4 吐絮期根际细菌群落多样性分析 54-56 3.2.5 收获期根际细菌群落多样性分析 56-59 3.3 讨论 59 3.4 小结 59-60 参考文献 60-62第四章微生物有机肥对棉花不同生育期根际土壤中真菌多样性的影响 62-78 4.1 材料与方法 62-65 4.1.1 供试材料 62 4.1.2 试验设计 62 4.1.3 试验时间 62 4.1.4 土壤样品采集 62 4.1.5 土壤总DNA的提取 62 4.1.6 PCR扩增 62-63 4.1.7 DGGE及DGGE凝胶的分析 63-64 4.1.7.1 实验试剂及配置 63-64 4.1.7.2 变性胶的制备 64 4.1.7.3 电泳 64 4.1.7.4 染色 64 4.1.8 DGGE条带测序及分析 64 4.1.8.1 PCR产物的纯化 64 4.1.8.2 连接反应 64 4.1.8.3 感受态细胞Escherichia coli DH5α的制备 64 4.1.8.4 转化 64 4.1.8.5 阳性克隆的检测 64 4.1.9 分析与统计 64-65 4.2 结果与分析 65-74 4.2.1 苗期根际真菌群落多样性分析 65-66 4.2.2 现蕾期根际真菌群落多样性分析 66-68 4.2.3 花铃期根际真菌群落多样性分析 68-70 4.2.4 吐絮期根际真菌群落多样性分析 70-72 4.2.5 收获期根际真菌群落多样性分析 72-74 4.3 讨论 74-75 4.4 小结 75-76 参考文献 76-78第五章微生物有机肥对棉花不同生育期根际土壤中病原真菌数量的影响 78-88 5.1 材料与方法 78-79 5.1.1 供试材料 78 5.1.2 试验设计 78 5.1.3 试验时间 78 5.1.4 土壤样品采集 78 5.1.5 土壤总DNA的提取 78-79 5.1.6 实时荧光定量PCR分析 79 5.1.6.1 荧光定量PCR扩增条件 79 5.1.6.2 荧光定量PCR标准曲线的绘制 79 5.1.7 分析与统计 79 5.2 结果与分析 79-84 5.2.1 Real-time PCR对第一季棉花黄萎病根际土壤中大丽轮枝菌的绝对定量 79-82 5.2.1.1 荧光定量PCR反应的优化 79-80 5.2.1.2 标准曲线 80-81 5.2.1.3 Real-time PCR对棉花黄萎病根际土壤中大丽轮枝菌的绝对定量 81-82 5.2.2 Real-time PCR对第二季棉花黄萎病根际土壤中大丽轮枝菌的绝对定量 82-83 5.2.2.1 荧光定量PCR反应标准曲线 82 5.2.2.2 Real-time PCR对棉花黄萎病根际土壤中大丽轮枝菌的绝对定量 82-83 5.2.3 Real-time PCR对第三季棉花黄萎病根际土壤中大丽轮枝菌的绝对定量 83-84 5.2.3.1 荧光定量PCR反应标准曲线 83 5.2.3.2 Real-time PCR对棉花黄萎病根际土壤中大丽轮枝菌的绝对定量 83-84 5.3 讨论 84-85 5.4 小结 85-86 参考文献 86-88全文结论及创新点 88-90 一、全文结论 88 二、本研究的创新点 88-90附录 90-98 附录一棉花根际土壤细菌DGGE分析部分条带序列 90-93 附录二棉花根际土壤真菌DGGE分析部分条带序列 93-98致谢 98-100读研期间发表的论文 100

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