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玉米光周期敏感基因ZmELF4的克隆及功能验证
作 者: 张少方
导 师: 陈彦惠
学 校: 河南农业大学
专 业: 作物遗传育种
关键词: 玉米 光周期敏感 EARLY FLOWERING 4 荧光定量PCR 转基因 亚细胞定位
分类号: S513
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
热带、亚热带玉米种质具有丰富的遗传变异性,对其改良和利用是拓宽我国种质资源的有效途径。然而,影响其在温带地区利用的最主要限制因素就是光周期敏感性。因此,分离、克隆玉米光周期敏感相关基因并探知其功能,从分子水平揭示玉米光周期敏感现象、钝化光周期敏感性,对热带、亚热带玉米种质的有效利用具有重要的理论和实践意义。本研究以热带玉米自交系CML288和温带玉米自交系黄早4为材料,利用同源克隆的方法克隆了与拟南芥ELF4、水稻OsELF4基因同源的玉米ZmELF4基因;利用荧光定量PCR技术,研究了不同材料相同光照、同一材料不同光照、不同组织、不同的发育阶段以及其在非光周期条件下ZmELF4基因的表达规律,分析了ZmELF4基因与ZmCOL和ZmCCA1的关系;构建了ZmELF4基因的融合表达载体及过量表达载体,并分别通过洋葱表皮瞬时表达实验进行了亚细胞定位研究,通过农杆菌介导花序侵染法进行了过量表达转基因功能验证。主要研究结果如下:1.利用基因同源克隆技术,首次克隆了玉米的ZmELF4基因,GenBank登录号为HQ009862。该基因序列中不存在内含子,但是在5’非编码区DNA序列中有一段约169bp的插入序列,而cDNA序列中没有该段序列。获得的cDNA序列全长约680bp,含有432bp的开放性阅读框,推测其编码一条含有144个氨基酸的肽链。系统进化树分析发现,ZmELF4与水稻OsELF4位于同一进化分枝,其亲缘关系最近。蛋白结构预测显示其含有保守的未知功能的DUF1313结构域,推测其是ELF4/OsELF4的同源基因。2.应用实时荧光定量PCR研究了ZmELF4基因在CML288和黄早4中,在长短日照两种处理条件下的昼夜节律表达规律及其在不同组织、不同的发育阶段的表达规律,分析了ZmELF4基因与拟南芥CCA1和CO在玉米中的同源基因ZmCCA1、ZmCOL的表达关系。结果表明,无论是CML288还是黄早4,长短日照条件下,在叶片与茎尖中ZmELF4基因的表达都呈现出节律性,当把植株挪移到连续光照条件下后这个节律仍然不变,只是表达的振幅逐渐降低而已,并且两种材料在相应的长短日照条件下表达高峰时期一致,只是整体表达量不同;在玉米的不同发育阶段、不同组织ZmELF4也都表达,但是两种材料中的表达又明显存在差异;此外,将ZmELF4的表达规律与ZmCCA1和ZmCOL的表达规律相比较发现,它们之间存在密切的关系,并且ZmELF4与ZmCOL的表达高峰都处在光周期诱导开花的敏感时期内,推测ZmELF4可能与两者相互作用,通过某种途径共同调控玉米光周期诱导开花的过程。3.利用基因重组技术,成功构建了带有GFP标记的融合表达载体pGIT-ZmELF4-GFP和能够高效表达的过量表达载体pBI-ZmELF4,通过洋葱表皮瞬时表达实验对ZmELF4进行了亚细胞定位研究,结果将其定位于细胞核;通过农杆菌介导花序侵染法将过量表达载体pBI-ZmELF4导入拟南芥进行间接功能验证,获得了7株阳性转化苗,且转化苗的开花期平均比野生型拟南芥推迟了25天左右,叶片数也比野生型多10片。
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全文目录
致谢 4-9摘要 9-11第一章 文献综述 11-30 1. 植物的光周期现象及其分子机制的研究进展 11-19 1.1 光周期及光周期敏感现象 11 1.2 光周期中光期和暗期的作用 11-12 1.3 拟南芥光周期作用分子机制的研究进展 12-18 1.3.1 光受体 12-14 1.3.2 生物钟组分 14-16 1.3.3 下游的转录调控因子 16 1.3.4 成花信号综合子 16-17 1.3.5 抑制因子 17-18 1.4 水稻光周期作用分子机制的研究进展 18-19 2. 玉米光周期敏感现象的研究进展 19-22 2.1 玉米光周期敏感现象 19 2.2 玉米光周期敏感指标及特性 19-20 2.3 玉米光周期敏感时期的研究 20 2.4 玉米光周期敏感相关基因的定位研究 20-21 2.5 玉米光周期敏感相关基因的克隆与研究 21-22 3. 拟南芥ELF4 基因及其在其它物种中同源基因的研究进展 22-23 3.1 拟南芥ELF4 基因的研究进展 22-23 3.2 ELF4-like 基因在其它物种中同源基因的研究进展 23 4. 同源序列克隆法 23-25 4.1 基因同源序列克隆法的原理 23-24 4.2 同源序列克隆法的优点及存在的问题 24-25 5. 实时荧光定量PCR 技术 25-26 5.1 实时荧光定量 PCR 技术原理 25-26 5.2 实时荧光定量 PCR 技术的优点 26 6. 亚细胞定位技术 26-28 6.1 免疫荧光技术 27 6.2 免疫胶体金标记 27 6.3 融合报告基因定位法 27-28 7. 拟南芥转基因方法的研究 28-30第二章 玉米光周期敏感基因ZmELF4 的克隆 30-44 1. 材料与方法 30-35 1.1 实验材料 30-31 1.2 试剂与仪器 31 1.3 方法 31-35 1.3.1 总 RNA 的提取与纯化 31-32 1.3.2 DNA 的提取与纯化 32-33 1.3.3 cDNA 第一链的合成 33-34 1.3.4 玉米ZmELF4 基因片段的克隆 34-35 1.3.4.1 玉米ZmELF4 基因的PCR 扩增 34 1.3.4.2 玉米ZmELF4 基因PCR 扩增产物的回收、连接与转化 34-35 1.3.5 测序结果分析 35 2. 结果与分析 35-42 2.1 RNA 提取、纯化、第一链合成及检测 35-36 2.2 玉米ZmELF4 基因的克隆与分析 36-42 2.2.1 玉米ZmELF4 基因的克隆 36 2.2.2 玉米ZmELF4 基因序列分析 36-42 2.2.2.1 CML288 和黄早4 中ZmELF4 基因cDNA、DNA 和氨基酸序列的比较分析 36-38 2.2.2.2 ZmELF4 基因的序列分析 38-40 2.2.2.3 玉米ZmELF4 基因的氨基酸序列分析 40-41 2.2.2.4 玉米 ZmELF4 基因的两种转录方式 41-42 3. 讨论 42-44 3.1 玉米ZmELF4 基因是ELF4/OsELF4 基因的同源基因 42-43 3.2 玉米ZmELF4 基因下一步亟待需要探讨的问题 43-44第三章 玉米ZmELF4 基因及其相关基因的表达分析 44-55 1. 材料与方法 44-46 1.1 供试材料 44-45 1.2 光周期处理与取样 45 1.3 试剂与仪器 45 1.4 方法 45-46 1.4.1 总 RNA 的提取与纯化 45 1.4.2 cDNA 第一链的合成 45 1.4.3 荧光定量 PCR 引物的设计 45-46 1.4.4 标准品的制备和标准曲线的建立 46 1.4.5 样品检测与数据处理 46 2. 结果与分析 46-52 2.1 基因标准曲线的建立 46-47 2.2 基因表达模式的研究 47-52 2.2.1 ZmELF4 基因的节律表达模式 47-49 2.2.2 ZmELF4 基因不同生长发育阶段在叶片与茎尖中的表达规律 49-50 2.2.3 ZmELF4 基因在玉米不同组织部位的表达 50 2.2.4 ZmELF4 基因与ZmCCA1 基因的表达关系 50-51 2.2.5 ZmELF4 基因与ZmCOL 基因之间的表达关系 51-52 3. 讨论 52-55 3.1 ZmELF4 基因周期表达模式及与ZmCCA1 基因之间的表达关系的探讨 52-53 3.2 ZmELF4 与ZmCOL 相互作用共同调控玉米光周期诱导开花的过程 53 3.3 玉米ZmELF4 基因在表达水平上需要进一步探讨的问题 53-55第四章 玉米ZmELF4 基因的初步功能验证 55-73 1. 材料与方法 55-65 1.1 材料 55 1.2 酶和试剂 55-56 1.3 菌株与质粒载体 56 1.4 主要仪器设备 56 1.5 实验方法 56-65 1.5.1 亚细胞定位实验方法 56-61 1.5.1.1 融合表达载体的构建 56-57 1.5.1.2 轰击前洋葱表皮的培养 57-58 1.5.1.3 金粉悬液制备 58-59 1.5.1.4 微弹制备(6 枪量) 59 1.5.1.5 基因枪轰击前操作 59-60 1.5.1.6 基因枪轰击操作步骤(PDS-1000/He 型基因枪) 60 1.5.1.7 轰击后洋葱表皮的培养 60 1.5.1.8 荧光显微镜观察 60-61 1.5.2 拟南芥过量表达实验 61-65 1.5.2.1 过量表达载体的构建 61-62 1.5.2.2 拟南芥转化 62-64 1.5.2.3 转基因拟南芥的筛选鉴定 64-65 1.5.2.4 转基因拟南芥植株的表型鉴定 65 2. 结果与分析 65-72 2.1 融合表达表达载体的构建 65-66 2.2 洋葱表皮瞬时表达结果 66-67 2.3 ZmELF4 基因过量表达载体的构建 67-68 2.4 重组质粒PBI-ZmELF4 转化农杆菌 68-69 2.5 转基因拟南芥的筛选 69 2.6 转基因拟南芥的PCR 验证 69-70 2.7 转基因拟南芥的表型观察与比较 70-72 3. 讨论 72-73 3.1 玉米ZmELF4 是核定位蛋白 72 3.2 玉米 ZmELF4 基因具有与拟南芥ELF4 基因相似的功能 72 3.3 玉米ZmELF4 基因在功能验证上需要进一步探讨的问题 72-73参考文献 73-79ABSTRACT 79-80
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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 玉米(玉蜀黍)
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