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大岛野路菊CcSOS1基因的克隆与表达分析

作　者: 卢军刚
导　师: 陈发棣
学　校: 南京农业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 大岛野路菊 质膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白 基因克隆 荧光定量PCR
分类号: S682.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 29次
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内容摘要


土壤中过多的Na+会导致植物产生盐害,严重影响植物生长和发育,而质膜型Na+/H+逆向转运蛋白可以将植物细胞内多余的Na+排出胞外,是植物抵御盐胁迫的主要方式之一,在植物耐盐性方面起着重要的作用。大岛野路菊为菊科菊属草本植物,原产日本沿海地区,具有良好的耐盐能力。本研究通过GenBank上登录的其它植物质膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因SOS1的保守序列设计简并引物,利用RT-PCR和RACE等技术克隆到了大岛野路菊质膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因的cDNA全长序列,命名为CcSOS1。序列分析显示,CcSOSl全长3752bp,开放阅读框(ORF)为3438bp,编码1145个氨基酸。疏水性和跨膜分析结果表明,CcSOSl的N-端高度疏水并含有12个跨膜区域,C-端高度亲水且全部位于细胞质中。序列比对发现,CcSOS1与葡萄VvSOS1、番茄S1SOS1和胡杨PeSOS1等的同源性较高,分别为79.11%、77.68%和76.04%。系统进化树分析表明,CcSOS1属于质膜型Na+/H+逆向转运蛋白。通过CcSOS1-GFP对CcSOSl进行亚细胞定位,结果显示CcSOS1位于细胞的质膜上。荧光定量PCR (qRT-PCR)显示,正常生长条件下CcSOSl基因在植物的根和叶中均有表达,且在叶片中的表达量稍高于根中的表达量,表明CcSOSl为组成型表达,且无明显的组织特异性。NaCl胁迫下,根中CcSOSl的表达水平在处理1h内便达到顶峰,约为对照的11倍,表明可显著提高CcSOSl在植物根中的表达水平；干旱(20%PEG6000)、低温(4℃)和ABA等处理也可不同程度地影响CcSOSl的表达,但具体影响形式互有差异；此外,在NaCl胁迫时添加外源Ca2+可提高植物根中CcSOSl的表达水平。通过插入中间片段在植物表达载体中添加了新的限制酶酶切位点的方法,成功构建CcSOSl基因的植物双元表达载体pC AMBI A-1301-220-CcSOSl,为进行植物转化并深入研究CcSOS1基因的功能奠定了基础。

全文目录


摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
缩略词  10-11
引言  11-12
第一章 文献综述  12-30
  1 盐胁迫对植物的危害  12-14
    1.1 渗透胁迫  13
    1.2 离子胁迫及单盐毒害  13
    1.3 生理代谢紊乱  13-14
  2 植物的耐盐机制  14-20
    2.1 避盐机制  14-15
      2.1.1 拒盐  14
      2.1.2 排盐  14
      2.1.3 稀盐  14-15
    2.2 渗透调节机制  15-18
      2.2.1 有机渗透调节  15-18
      2.2.2 无机渗透调节  18
    2.3 离子区隔化机制  18-19
    2.4 其它耐盐机制  19-20
  3 Na~+/H~+逆向转运蛋白研究进展  20-30
    3.1 液泡膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白  21-23
    3.2 质膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白  23-26
    3.3 SOS基因家族及SOS信号途径  26-30
      3.3.1 SOS基因家族  26-27
      3.3.2 SOS基因的调控途径  27-30
第二章 大岛野路菊CcSOS1基因的克隆与序列分析  30-50
  1 材料与方法  30-39
    1.1 植物材料  30
    1.2 试剂与仪器  30
      1.2.1 试剂及菌株  30
      1.2.2 仪器设备  30
    1.3 实验方法  30-39
      1.3.1 植物总RNA的提取  30-31
      1.3.2 1st-Strand cDNA合成及检测  31-32
      1.3.3 简并引物的设计  32
      1.3.4 PCR扩增及电泳  32-33
      1.3.5 目的片段的纯化回收  33-34
      1.3.6 目的片段的连接  34
      1.3.7 连接产物转化  34
      1.3.8 重组子筛选与测序  34-35
      1.3.9 3'RACE-PCR  35-36
      1.3.10 5'RACE-PCR  36-38
      1.3.11 cDNA全长序列的获得  38
      1.3.12 基因序列的分析  38-39
  2 结果与分析  39-47
    2.1 RNA提取质量与反转录效果检测  39
    2.2 CcSOS1基因的克隆  39-41
      2.2.1 CcSOS1基因中间保守片段的获得  39-40
      2.2.2 CcSOS1基因3'RACE结果  40
      2.2.3 CcSOS1基因5'RACE结果  40-41
      2.2.4 CcSOS1基因cDNA全长的获得  41
    2.3 CcSOS1基因的序列分析  41-47
      2.3.1 CcSOS1基因cDNA序列的分析  41
      2.3.2 CcSOS1基因氨基酸序列的分析  41-46
      2.3.3 CcSOS1的系统进化树分析  46-47
  3 讨论  47-50
第三章 大岛野路菊CcSOS1基因的表达分析  50-70
  1 材料与方法  50-59
    1.1 植物材料  50
    1.2 试剂与仪器  50
      1.2.1 试剂及菌株  50
      1.2.2 仪器设备  50
    1.3 实验方法  50-59
      1.3.1 CcSOS1的亚细胞定位  50-56
      1.3.2 不同处理下CcSOS1基因的表达分析  56-57
      1.3.3 CcSOS1基因植物双元表达载体的构建及保存  57-59
  2 结果与分析  59-68
    2.1 CcSOS1的亚细胞定位  59-64
      2.1.1 植物转化载体的构建  59-62
      2.1.2 CcSOS1的亚细胞定位  62-64
    2.2 CcSOS1基因在不同处理下的表达情况  64-66
    2.3 CcSOS1基因植物双元表达载体的构建  66-68
  3 讨论  68-70
全文结论  70-72
创新点  72-74
参考文献  74-84
附录  84-86
攻读学位期间发表的论文  86-87
致谢  87

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 观赏园艺（花卉和观赏树木） > 多年生花卉类 > 宿根花卉类 > 菊花
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