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荧光定量PCR方法在土传烟草青枯病生防研究中的应用

作　者: 陈巧玲
导　师: 沈其荣；胡江
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物营养学
关键词: 烟草青枯病生物防治根际微生物荧光定量PCR 茄科劳尔氏菌
分类号: S435.72
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

烟草青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的细菌性土传病害,是烟草生产上的毁灭性病害。由于常规防治方法存在种种弊端,根际细菌介导的生物防治正成为备受人们关注的一种有效方法。本实验室筛选到一株拮抗效果较好的短短芽孢杆菌,经二次发酵用于烟草青枯病的防治。并且运用文献报道的引物,建立起10种微生物的荧光定量PCR扩增方法,为快速检测根际微生物群落数量,探索病原茵和拮抗菌在烟草根际的互作效应,从而进一步了解生物有机肥对土壤微生物群落结构的影响提供了可靠的方法。研究结果分述如下：(1)运用文献报道引物分别对细菌、真菌、固氮菌、劳尔氏菌以及硝化细菌等10种微生物进行荧光定量PCR扩增,优化反应条件,绘制标准曲线方程。扩增结果显示建立的荧光定量PCR方法扩增效率达到90%～105%(R2>0.99),符合定量检测要求,引物特异性好,引物浓度适宜,没有引物二聚体干扰,退火温度适宜。(2)分别采用传统的平板计数法与荧光定量PCR法对土壤中已知浓度的劳尔氏菌进行检测,以验证荧光定量PCR方法的相对可靠性。试验结果表明,荧光定量PCR检测速度快,操作简单,检测结果比平板计数结果更接近理论值,且三次试验的重复性比平板计数结果更好,说明荧光定量PCR法检测土壤中微生物具有准确率高、可重复性好等优点,可用于土壤微生物的快速检测。(3)采用盆栽试验的方法,检验生物有机肥对烟草青枯病的防治效果。试验结果表明,施用生物有机肥显著降低了抗病品种K326和感病品种南江三号烟草青枯病的发病率,且还促进了烟草生长,生物量增加14%以上。(4)采用荧光定量PCR方法,研究了生物有机肥处理对盆栽烟草根际青枯病原茵及拮抗茵动态变化的影响。结果表明：只接种病原菌处理(RS)土壤中青枯病原菌的fliC基因拷贝数显著高于先接种病原菌再施用生物有机肥处理(RS+BIO)和先施用生物有机肥后接种病原菌处理(BIO+RS)土壤中fliC基因拷贝数,且这种效应与生育期和品种无关。旺盛生长期前,施用生物有机肥处理土壤中短小芽孢杆菌属拮抗菌的16S rRNA基因拷贝数也显著高于RS处理,说明生物有机肥将大量拮抗菌带入土壤并在根周定殖。(5)2010年在福泉青枯病严重的连作田块上进行了“BIO”功能性微生物肥料的生防试验的研究。大田移栽前施用“BIO"功能性微生物肥料,移栽后不同时期调查烟草青枯病的病情指数,以验证功能性肥料的生防效果。感病品种红花大金元在收获前发病率为100%,所有处理病情指数同对照相当,抗病品种K326所有处理发病较轻,发病率和病情指数间没有差异。抗青枯病性“BIO”微生物肥料在50g/穴剂量下对烟草青枯病没有生防效果。在今后青枯病大田试验中应在控制烟草黑胫病的前提下进行。

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摘要 8-10ABSTRACT 10-12第一章文献综述 12-28 1 烟草青枯病研究进展 12-15 1.1 青枯病的发生与危害 12 1.2 茄科劳尔氏菌的分类及其生物学特性 12-13 1.3 青枯病的发病规律及致病机理 13 1.4 青枯病的防治 13-15 1.4.1 抗病品种的选育 13-14 1.4.2 实行耕作控制 14 1.4.3 化学防治 14 1.4.4 生物防治 14-15 2 土壤微生物群落的研究意义 15-16 3 土壤微生物群落方法研究进展 16-20 3.1 琼脂培养基培养方法 16-17 3.2 Biolog GN方法 17-18 3.3 磷脂脂肪酸方法 18 3.4 分子生物学方法 18-20 4 荧光定量PCR(Real-Time PCR)技术的应用 20-27 4.1 Real-Time PCR技术的原理 20-22 4.2 Real-Time PCR技术的应用 22-24 4.3. Real-Time PCR技术的优缺点 24-26 4.4 Real-Time PCR的应用前景及展望 26-27 5 本研究的目的和意义 27-28第二章荧光定量PCR方法的建立 28-40 2.0 引言 28 2.1 材料与方法 28-35 2.1.1 菌株与培养基 28-29 2.1.2 常用储备液及缓冲液 29 2.1.3 试剂、工具酶与仪器 29-30 2.1.4 土壤DNA提取与检测 30 2.1.5. PCR扩增 30 2.1.6 电泳检测 30-31 2.1.7 PCR产物的回收、克隆和测序 31-34 2.1.8 荧光定量PCR标准曲线的制备 34 2.1.9 验证试验方法 34-35 2.2 结果与分析 35-36 2.2.1 荧光定量PCR标准曲线结果分析 35 2.2.2 验证试验结果与分析 35-36 2.3 讨论 36-40第三章生物有机肥对烟草根际青枯病菌和拮抗菌动态变化影响的Real-Time PCR检测 40-48 3.0 引言 40 3.1 材料与方法 40-42 3.1.1 菌种来源 40 3.1.2 微生物肥料的发酵 40-41 3.1.3 试验设计 41 3.1.4 土壤样品的采集及DNA的提取 41 3.1.5 生物有机肥防治效果 41 3.1.6 生物有机肥对烟草生长的影响 41-42 3.1.7 荧光定量PCR标准曲线的建立 42 3.1.8 土壤样品荧光定量PCR检测 42 3.2 结果与分析 42-45 3.2.1 微生物有机肥防治青枯病的效果 42 3.2.2 生物有机肥的促生效果 42-43 3.2.3 目标菌荧光定量PCR标准曲线的绘制 43 3.2.4 荧光定量PCR实时监测烤烟移栽后根际青枯病菌数量的变化 43-44 3.2.5 荧光定量PCR实时监测烤烟移栽后根际拮抗菌数量的变化 44-45 3.3 讨论 45-48 3.3.1 生物有机肥对烟草生长及其青枯病病情的影响 45-46 3.3.2 荧光定量PCR方法的建立及检测结果 46-48第四章生物有机肥对烟草病害田间生防试验 48-56 4.0 引言 48 4.1 试验材料与方法 48-50 4.1.1 试验处理 48-50 4.1.2 土样采集及总DNA的提取 50 4.1.3 荧光定量PCR扩增 50 4.1.4 生物有机肥防治效果 50 4.2 结果与分析 50-53 4.2.1 肥料防治效果 50-51 4.2.2 肥料对烤烟主要经济性状的影响 51-52 4.2.3 烤烟根际土壤微生物群落数量调查 52-53 4.3 讨论 53-56 4.3.1 生物有机肥防治烟草青枯病效果 53-54 4.3.2 荧光定量PCR法检测烟草根际微生物数量 54-56全文总结 56-58参考文献 58-72附录 72-84 附录一烟草根际土壤微生物荧光定量PCR标准曲线扩增图形分析 72-84致谢 84-86作者简介 86-88硕士在读期间发表的论文 88

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