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五个棉花逆境相关锌指蛋白基因的克隆与功能研究

作　者: 王晋成
导　师: 郭旺珍
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 棉花 锌指蛋白 逆境胁迫 黄萎病 实时荧光定量PCR
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


棉花是世界上重要的经济作物,是纺织工业最重要的天然原料。陆地棉是棉花最主要的栽培种,其产量占全球棉花总产量的90%以上。但是由于棉花的种植地区大都位于干旱和半干旱的地区,各种自然灾害,比如干旱、盐碱、低温、枯黄萎痛都严重制约着棉花产量和品质的提高。培育高抗的棉花品种是棉花育种的主要任务之一。逆境胁迫,包括生物胁迫和非生物胁迫,是危害农业生产的主要因素。因此,如何消除或减少逆境胁迫对农作物造成的危害是进行作物抗逆性研究的基本思路。植物能够感受刺激、传递信号由此引起基因表达的变化并最终产生抗逆效应,表达调控是整个调控通路中的核心,包括蛋白的上调表达和下调表达,下调表达包括蛋白质合成减少和对某些已存在蛋白质的选择性降解。锌指蛋白是一类与锌离子结合并折叠成手指状结构的蛋白质的总称,是转录因子数量最多的成员。锌指结构域主要依靠半胱氨酸和组氨酸来结合锌离子,其排列顺序决定了锌指蛋白结合锌离子的方式。锌指结构域功能多样,可以结合DNA、RNA.蛋白质和脂质,含有锌指结构域的蛋白质参与生物体生命活动的各个环节。在植物中,有些锌指蛋白,包括一些植物特有的锌指蛋白,参与植物对生物和非生物胁迫的应答反应。本研究以拟南芥和水稻中已报道的与逆境相关的锌指蛋白的氨基酸序列为探针,通过扫描棉花EST数据库,拼接了5个ORF完整的contig,设计专化引物从陆地棉品种晋棉19中分离了5个与逆境相关的锌指蛋白基因GhSAPl. GhZFP2、GhZFP3、GhBBX1和GhRCHYl,它们编码分别属于4个不同亚家族的锌指蛋白,其中GhSAP1、GhBBX1和GhRCHY1类锌指蛋白基因是首次从棉花中克隆得到。这5个锌指蛋白的cDNA长度分别为591、1005、1026、848和1106 bp, ORF全长分别为543、813、813、717和948bp,分别编码180、270、270、238和315个氨基酸,蛋白质理论上的分子量和等电点分别为8.97/19.3 kD、7.69/28.7 kD、8.68/28.6 kD、4.99/26.2 kD和6.06/36.0 kD。其中,GhSAP1包含一个A20和一个AN1锌指结构域,GhZFP2和GhZFP3都包含两个C2H2锌指结构域,GhBBX1包含2个B-Box锌指结构域,GhRCHY1包含一个CHY结构域和一个RING-H2锌指结构域。通过扩增陆地棉TM-1和海岛棉7124的BC1回交群体,进一步与我室构建的海陆高密度遗传图谱整合,完成上述克隆基因的染色体定位。GhSAP1被定位在第8号染色体(Chr.8, A8), GhZFP2被定位在第5号染色体(Chr.5, A5), GhZFP3被定位在第19号染色体(Chr.19, D5), GhBBX1被定位在第23号染色体(Chr.23, D9), GhRCHY1被定位在第18号染色体(Chr.18, D13)。通过分析GhZFPs基因在棉花根、茎、叶和胚珠等组织中的表达情况,结果表明这5个基因在开花5天后胚珠中的表达量都很低,而在根、茎、叶等组织中表达较高,其中GhZFP2和GhZFP3在根中的表达量最高,其余三个基因在根、茎和叶片中的表达量差异不大。采用实时荧光定量PCR方法检测GhZFPs基因在受到非生物和生物胁迫后的表达情况。结果表明GhRCHY1受干旱诱导后表达最强烈,其次是GhSAP1和GhZFP2; GhSAPl受NaCl和ABA诱导后表达最强烈,其次是GhZFP3和GhBBX1; GhZFP3受低温诱导后表达最强烈,GhZFP2受黄萎病菌诱导后表达最强烈,与对照相比上述差异都达到了极显著水平。研究结果表明,这五个锌指蛋白基因不同程度地参与棉花对生物胁迫和非生物胁迫的响应,是与棉花的逆境胁迫相关的蛋白基因,目前正在对这五个基因作更进一步的研究。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10本文所用缩略语  10-12第一部分 综述  12-50  第1章 非生物胁迫与植物抗逆性研究  12-16  第2章 非生物胁迫相关的基因  16-30    2.1 逆境胁迫相关转录因子  16-25      2.1.1 AP2/EREBP  16-18      2.1.2 NAC  18-21      2.1.3 MYB  21-22      2.1.4 bZIP  22-23      2.1.5 HD-Zip  23-25      2.1.6 ZFP  25    2.2 泛素途径相关蛋白  25-30      2.2.1 泛素  25-26      2.2.2 蛋白酶体  26      2.2.3 E1、E2和E3  26-27      2.2.4 泛素调节的蛋白质降解的生物学意义  27-30  第3章 逆境相关锌指蛋白研究进展  30-50    3.1 锌指蛋白是一个拥有众多成员的庞大家族  30-32    3.2 锌指蛋白的作用模式  32-35      3.2.1 结合DNA  32-33      3.2.2 结合RNA  33-34      3.2.3 蛋白互作  34-35      3.2.4 结合脂质  35    3.3 逆境相关锌指蛋白  35-41      3.3.1 WRKY  35-37      3.3.2 TFⅢA  37-39      3.3.3 锌指蛋白家族中与非生物胁迫应答相关的其他成员  39-41    3.4 本研究中的锌指蛋白  41-46      3.4.1 AN1-A20 domain containing finger(SAP)  41      3.4.2 C2H2 domain containing finger  41-42      3.4.3 B-BOX domain containing finger(BBX)  42-43      3.4.4 RING and CHY domain containing Finger(RCHY)  43-46    3.5 本研究的目的和意义  46-50第二部分 研究报告  50-102  第4章 五个棉花逆境相关锌指蛋白基因的克隆和表达特性分析  50-102    4.1 材料  51-54      4.1.1 植物材料  51-52      4.1.2 菌株  52      4.1.3 载体  52      4.1.4 培养基  52      4.1.5 植物生长调节剂和抗生素  52      4.1.6 酶和试剂  52-53      4.1.7 试剂盒  53      4.1.8 引物  53      4.1.9 网络资源和应用软件  53-54    4.2 方法  54-65      4.2.1 同源EST检索、拼接与分析  54-55      4.2.2 引物的设计与合成  55-56      4.2.3 棉花总RNA的提取与cDNA的合成  56-58      4.2.4 棉花基因组DNA的提取  58-59      4.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化和克隆检测  59-61      4.2.6 质粒的提取与检测  61      4.2.7 序列的PCR扩增、回收、克隆和测序  61-63      4.2.8 GhZFPs基因的染色体定位分析  63      4.2.9 植物材料的胁迫处理  63-64      4.2.10 实时荧光定量PCR分析  64-65    4.3 结果与分析  65-98      4.3.1 陆地棉锌指蛋白转录因子的克隆  65-69      4.3.2 GhZFPs基因cDNA序列的测定与部分特性分析  69-81      4.3.3 GhZFPs基因DNA序列的测定与基因组结构分析  81-82      4.3.4 GhZFPs基因的染色体定位分析  82-84      4.3.5 GhZFPs基因氨基酸序列分析及与同类锌指蛋白的比较  84-91      4.3.6 GhZFPs基因组织特异性表达分析  91      4.3.7 GhZFPs基因在胁迫诱导下的表达分析  91-98    4.4 讨论  98-102      4.4.1 GhZFPs的电子克隆  98-99      4.4.2 锌指蛋白基因的染色体定位  99      4.4.3 这五个锌指蛋白基因参与棉花的抗逆反应  99-102全文结论  102-104附录  104-110参考文献  110-128致谢  128

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 纤维作物 > 棉
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