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猪流行性乙型脑炎双抗夹心ELISA方法的建立与试剂盒的制备

作　者: 张宁
导　师: 丁壮
学　校: 吉林大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 流行性乙型脑炎 E蛋白单克隆抗体双抗夹心ELISA 试剂盒
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

猪流行性乙型脑炎是由流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus ,JEV)引起的一种人兽共患传染病。该病主要分布于东南亚各国,被列为重点控制的疾病。猪感染后,体内的带毒量和带毒时间相对于其他动物来说是最高和最长的,因此,猪是主要的储存和传播宿主。本研究建立了检测猪流行性乙型脑炎病毒的双抗夹心ELISA方法,制备了试剂盒,为我国猪流行性乙型脑炎的流行病学调查、防控技术集成和示范体系建立提供了技术保障。本研究通过PCR扩增出了流行性乙型脑炎弱毒(SA14-14-2株)E蛋白基因序列,连接到载体PET-28a中,成功构建了PET28a-E表达载体,在IPTG的诱导下进行了表达,经Ni-NTA纯化获得JEV E蛋白抗原,并在此基础上建立了以JEV E蛋白为基础的间接ELISA方法。用纯化后的流行性乙型脑炎病毒(P3株)免疫新西兰大白兔,获得了效价为1:16000的兔抗乙型脑炎多克隆抗体,经辛酸-硫酸铵及DEAE离子交换纯化后-80°C保存。然后,对4只7周龄雌性Balb/c小鼠进行免疫,取第1只和第3只效价较高的鼠脾细胞与骨髓淋巴细胞进行融合,通过间接ELISA方法,对杂交瘤细胞进行筛选,建立了2株分泌稳定的杂交瘤细胞株,命名为6A8株和3E9株,腹水效价分别为3E9(1:1.2×105)>6A8 (1: 8.2×104)。免疫组织特异性分析结果显示,3E9株的特异性高于6A8株,因此,选3E9株作为双抗夹心法的特异性抗体,建立双抗夹心ELISA方法,通过对各个条件的优化,选择兔多克隆抗体为捕获抗体,这样有利于病毒的吸附,鼠单抗为检测抗体,提高检测结果的特异性,多抗按1:8000稀释,单抗稀释到0.5μg/mL,制备试剂盒。本研究在对流行性乙型脑炎病毒E蛋白基因克隆和表达的基础上,构建了间接ELISA法,并制备了兔抗乙脑的多克隆抗体和鼠单克隆抗体。据此,建立了双抗加心ELISA法,其敏感性、特异性及可重复性达到了实验要求。制备了猪流行性乙型脑炎试剂盒,并对实际样品和实验样品进行了检测,为建立全国性猪流行性乙型脑炎监控网络和预警平台提供有效的技术手段。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
前言  11-12
第一篇文献综述  12-28
  第1章流行性乙型脑炎的研究进展  12-24
    1.1 乙型脑炎发展史  12
    1.2 乙型脑炎种系的变异  12
    1.3 乙型脑炎的进化与传播  12-13
    1.4 乙型脑炎的流行趋势  13-14
    1.5 乙型脑炎病毒的生物学特性  14-15
    1.6 乙型脑炎周期性循环  15-16
    1.7 乙型脑炎季节性  16
    1.8 乙型脑炎病理学特性  16-17
    1.9 乙型脑炎免疫学特性  17-18
    1.10 乙型脑炎疫苗  18-19
    1.11 乙型脑炎的诊断方法  19-22
    1.12 乙型脑炎的治疗  22-24
  第2章双抗夹心ELISA 方法的研究进展  24-28
    2.1 双抗夹心ELISA 方法的实验原理  24-25
    2.2 双抗夹心ELISA 方法的特点  25
    2.3 双抗加心ELISA 方法的在国内外的应用  25-28
第二篇研究内容  28-60
  第一章猪流行性乙型脑炎囊膜E 蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备  28-41
    1.1 材料  28-30
    1.2 方法  30-33
    1.3 结果  33-39
    1.4 讨论  39
    1.5 小结  39-41
  第二章抗流行性乙型脑炎单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定  41-50
    2.1 材料  41-42
    2.2 方法  42-44
    2.3 结果  44-48
    2.4 讨论  48-49
    2.5 小结  49-50
  第3章猪流行性乙型脑炎双抗夹心ELISA方法的建立与试剂盒的研制  50-60
    3.1 材料  50
    3.2 方法  50-53
    3.3 结果  53-57
    3.4 讨论  57-58
    3.5 小结  58-60
结论  60-61
参考文献  61-71
导师简介  71-72
作者简介  72-73
致谢  73

猪流行性乙型脑炎双抗夹心ELISA方法的建立与试剂盒的制备

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