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CEA MAB的制备、纯化及其双抗夹心ELISA检测方法的初步建立

作　者: 谢永华
导　师: 张彦定
学　校: 福建师范大学
专　业: 发育生物学
关键词: CEA 单克隆抗体 Protein-G亲和层析柱 双抗夹心ELISA法 反应条件
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


癌胚抗原(CEA)是一种与细胞粘着有关的糖蛋白。结肠直肠癌,胃癌,胰腺癌,肺癌,乳腺癌和甲状腺髓样癌患者的血清的CEA表达水平明显高于正常个体。癌胚抗原被用作一种广谱性的肿瘤标志物,运用于大肠癌、乳腺癌、肺癌等癌症的疗效判断、病情发展、监测和预后估计。单克隆抗体是指一类由单一免疫细胞经过克隆后分泌产生的针对一种抗原决定簇的抗体。只要给出任一种底物,就能生产一种单克隆抗体使其专一地结合于那种底物上,所以单克隆抗体可以用来检测和鉴定相应的底物。酶联免疫吸附法是将抗原抗体反应的特异性和酶的高效催化作用相结合,而建立的一种非放射性标记免疫检测技术。此种技术能有效地检测出样品中抗原或抗体的含量。与其它抗体标记反应方法相比,ELISA有许多优点,如高特异性,高灵敏度,价格低廉且安全可靠。癌胚抗原单克隆抗体ELISA技术对于癌症检测的临床应用具有重要实践意义。本课题利用本实验室已有的CEA单克隆抗体细胞株生产合格的、与国外同类产品具有相同效价的CEA单克隆抗体。建立并优化双抗夹心ELISA方法,以便于CEA的临床检测。主要的研究工作包括：(1)采用杂交瘤细胞的有限稀释法,筛选出表达效率高的细胞株；细胞株经过筛选后的表达效率比原先提高了2倍左右。(2)利用小鼠腹水生产单抗；(3)用Protein-G亲和层析柱一步纯化的方法纯化腹水中的CEA单克隆抗体；(4)对生产的CEA单克隆抗体进行HRP标记及其效价测定；(5)双抗夹心ELISA方法检测CEA最适反应条件的建立。

全文目录


摘要  2-3
Abstract  3-5
中文文摘  5-7
目录  7-9
绪论  9-21
第一章 实验材料与方法  21-33
  第一节 实验材料  21-24
    1.1.1. 细胞和实验动物  21
    1.1.2. 实验仪器与设备  21
    1.1.3. 主要药品  21-22
    1.1.4. 耗材  22
    1.1.5. 试剂配制  22-24
  第二节 实验方法  24-33
    1.2.1. 复苏过程  24
    1.2.2. 冻存过程  24-25
    1.2.3. 细胞传代培养  25
    1.2.4. 细胞计数  25-26
    1.2.5. 杂交瘤细胞的克隆化筛选  26
    1.2.6. ELISA方法定量分析CEA mAb  26-27
    1.2.7. 腹水生产单抗  27
    1.2.8. 抗体纯化(Protein-G柱)  27
    1.2.9. 蛋白质电泳检测(考马斯亮蓝染色)  27-28
    1.2.10. 纯化后抗体与同类国外产品的效价比对  28
    1.2.11. 抗体的抗原决定簇的检测  28-29
    1.2.12. 抗体保存方法效价检测与比较  29
    1.2.13. CEA单克隆抗体的HRP标记法及效价测定  29
    1.2.14. 包被抗体与酶标抗体最佳稀释度的优化  29-30
    1.2.15. 包被液的选择  30
    1.2.16. 洗涤液的选择  30
    1.2.17. 封闭液的选择  30-31
    1.2.18. 封闭时间的选择  31
    1.2.19. 酶标抗体作用时间的优化  31
    1.2.20. ABTS底物作用时间的优化选择  31
    1.2.21. 双抗夹心ELISA标准曲线的建立  31-33
第二章 实验结果  33-53
  第一节:单抗的生产与纯化,及酶标一抗的制备与效价检测  33-45
    2.1.1. 细胞复苏与培养  33-34
    2.1.2. 杂交瘤细胞的有限稀释,筛选出表达效率高的细胞株  34-37
    2.1.3. 腹水生产及抗体效价的检测  37-40
    2.1.4. CEA单抗的纯化与纯化后抗体浓度检测  40-41
    2.1.5. 蛋白质电泳检测(考马斯亮蓝染色)  41-42
    2.1.6. 纯化后抗体与同类国外产品的效价比对  42-43
    2.1.7. 抗体的抗原决定簇的检测  43
    2.1.8. 抗体保存方法效价检测与比较  43-44
    2.1.9. CEA单克隆抗体的HRP标记率及效价测定  44-45
  第二节:双抗夹心ELISA方法检测癌胚抗原最适反应条件的建立  45-53
    2.2.1. 包被抗体与酶标抗体最佳稀释度的优化  45-46
    2.2.2. 包被液的选择  46-47
    2.2.3. 洗涤液的选择  47
    2.2.4. 封闭液的选择  47-48
    2.2.5. 封闭时间的选择  48-49
    2.2.6. 酶标抗体作用时间的优化  49
    2.2.7. ABTS底物作用时间的优化选择  49-50
    2.2.8. 标准曲线的绘制  50-53
第三章 分析与讨论  53-59
  第一节:单抗的生产与纯化,及酶标一抗的制备与效价检测  53-55
    3.1.1. CEA单克隆抗体与杂交瘤细胞的克隆化筛选表达效率高的细胞株  53
    3.1.2. 佐剂、饲养环境和小鼠种类对腹水生产单抗产量及其效价的影响  53-54
    3.1.3. 亲和层析法进行抗体纯化  54-55
    3.1.4. CEA单克隆抗体的HRP标记  55
  第二节:双抗夹心ELISA方法检测癌胚抗原最适反应条件的建立  55-59
    3.2.1. 双抗夹心ELISA检测方法的影响因素  55-56
    3.2.2. 包被条件和包被抗体浓度对夹心ELISA检测方法的影响  56
    3.2.3. 封闭液对夹心ELISA检测方法的影响  56
    3.2.4. 酶标抗体的稀释倍数和作用时间对ELISA检测方法的影响  56-57
    3.2.5. 底物的选择对ELISA检测方法的影响  57
    3.2.6. 双抗夹心ELISA法在癌胚抗原(CEA)检测中的优点与不足  57-59
第四章 结论  59-61
参考文献  61-67
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  67-69
致谢  69-71
个人简历  71-72

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学 > 实验室诊断 > 免疫学检验
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