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安徽省部分猪场生猪沙门氏菌带菌情况与耐药性研究

作　者: 张玮
导　师: 魏建忠；李郁
学　校: 安徽农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 沙门氏菌血清群多重耐药耐药基因复合PCR 荧光定量PCR
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 170次
引　用: 2次
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内容摘要

沙门氏菌(Salmonella)是一类重要的食源性致病菌,在人类健康和畜禽养殖中引起严重的危害。近三十年来,沙门氏菌的耐药性出现了明显的增强,多重耐药谱不断增宽,为沙门氏菌病的预防和治疗带来了极大的困难。生猪作为沙门氏菌的主要贮藏宿主之一,在沙门氏菌的散播及其对食品的污染方面扮演着重要的角色。利用PCR与常规技术相结合的方法,对安徽省不同地区六个规模化猪场三个生长阶段临床健康猪进行沙门氏菌的分离鉴定。共采集直肠棉拭子样品540份,分离到沙门氏菌22株,检出率为4.07%(22/540)。其中哺乳阶段的检出率为1.67% (3/180)、保育阶段为9.44%(17/180)、生长阶段为1.11% (2/180)。在被调查的六个猪场中,以安庆地区猪场的检出率最高,为18.89%(17/90)。22株沙门氏菌分离株分属三个血清群,其中B群3株,E1群2株,F群17株。对15种抗生素的感受性试验中,22株沙门氏菌对羟氨苄青霉素和四环素的耐受率最高,均为90.9%,而对头孢曲松和头孢哌酮最敏感,敏感率均达100%。耐4种以上抗生素的多重耐药菌株占分离菌株的90.9%(20/22),多重耐药谱为AMX-TET-KAN-CHL-FFC。表明安徽省部分规模化猪场不同生长阶段临床健康猪不同程度携带有沙门氏菌,分离菌株耐药性严重,多重耐药率极高。大多数分离菌株属于较少见的F群。运用PCR技术检测了沙门氏菌分离菌株的I类整合子和19种耐药基因。22株沙门氏菌有19株检测出I类整合子,检出率为86.4%(19/22)。对基因组和质粒DNA进行19种耐药基因检测,分别共检测出11种和8种耐药基因。建立了氨基糖苷类耐药基因三重PCR;氯霉素类耐药基因三重PCR和四环素类耐药基因两重PCR方法。既提高了检测效率,又保证检测的灵敏度和特异性。从检测的耐药基因中选择检出率最高的aph(3)-IIa为靶基因成功的建立了aph(3)-IIa基因的荧光定量PCR方法,最低检测度为8copies/μL。通过对22株沙门氏菌基因组DNA和质粒上aph(3)-IIa基因的定量检测,显示该方法能够快速、有效的检测出沙门氏菌所携带的aph(3)-IIa基因。表明荧光定量PCR方法具有快速、灵敏、特异性强的特点,可替代普通PCR方法来进行耐药基因的检测。22株沙门氏菌耐药基因调查发现I类整合子的携带与多重耐药性之间关系密切,耐药表型测定结果与耐药基因检测结果一致,基因组DNA携带的耐药基因种类多于质粒。

全文目录

中文摘要  4-5
Abstract  5-12
文献综述  12-22
1 引言  22-23
2 材料与方法  23-38
  2.1 材料  23-26
    2.1.1 样品来源  23
    2.1.2 参考菌株  23
    2.1.3 主要增菌液和培养基  23
    2.1.4 主要试剂  23
    2.1.5 细菌微量生化反应管  23
    2.1.6 抗生素药敏试验纸片  23-24
    2.1.7 所用引物和探针序列  24-25
    2.1.8 主要仪器  25-26
  2.2 方法  26-38
    2.2.1 沙门氏菌的分离培养  26
    2.2.2 沙门氏菌分离株的生化试验  26
    2.2.3 沙门氏菌分离株的血清学试验  26-27
    2.2.4 沙门氏菌分离株的PCR 鉴定  27
      2.2.4.1 沙门氏菌总DNA 的提取  27
      2.2.4.2 沙门氏菌ⅠnvA 基因PCR 扩增  27
      2.2.4.3 PCR 产物分析  27
    2.2.5 沙门氏菌血清群的鉴定  27-28
    2.2.6 沙门氏菌药敏试验  28
    2.2.7 沙门氏菌基因组DNA 的提取  28
    2.2.8 沙门氏菌质粒的提取  28-29
    2.2.9 Ⅰ 类整合子和19 种耐药基因的PCR 扩增检测  29-31
      2.2.9.1 Ⅰ 类整合子5’端整合酶和3’端保守区PCR 扩增  29-30
      2.2.9.2 Ⅰ 类整合子基因盒PCR 扩增  30
      2.2.9.3 19 种耐药基因PCR 扩增  30-31
      2.2.9.4 PCR 产物分析  31
    2.2.10 耐药基因多重PCR 方法的建立  31-33
      2.2.10.1 沙门氏菌总DNA 的提取  31
      2.2.10.2 多重PCR 反应条件优化方案  31
      2.2.10.3 氨基糖苷类耐药基因三重PCR 方法的建立  31-32
      2.2.10.4 氯霉素类耐药基因三重PCR 方法的建立  32
      2.2.10.5 四环素类耐药基因二重PCR 方法的建立  32-33
      2.2.10.6 PCR 产物分析  33
    2.2.11 荧光定量PCR  33-38
      2.2.11.1 标准品的制备  33-36
      2.2.11.2 沙门氏菌中aph(3)-Ⅱa 基因的定量  36-38
3 结果与分析  38-52
  3.1 临床健康猪直肠沙门氏菌的分离鉴定结果  38-40
    3.1.1 沙门氏菌的分离鉴定  38
    3.1.2 沙门氏菌分离株的PCR 鉴定  38-39
    3.1.3 沙门氏菌分离株生化试验鉴定结果  39
    3.1.4 沙门氏菌分离株血清群分布情况  39-40
  3.2 规模猪场临床健康猪沙门氏菌带菌情况  40
  3.3 沙门氏菌分离株药物感受性情况  40-42
  3.4 沙门氏菌分离株Ⅰ 类整合子和耐药基因检测结果  42-52
    3.4.1 22 株沙门氏菌Ⅰ 类整合子检测结果  42-43
    3.4.2 沙门氏菌分离株基因组DNA 耐药基因检测结果  43-44
    3.4.3 沙门氏菌分离株质粒耐药基因检测结果  44-45
    3.4.4 耐药基因多重PCR 方法的建立结果  45-47
      3.4.4.1 氨基糖苷类耐药基因三重PCR 方法的建立  45-46
      3.4.4.2 氯霉素类耐药基因三重PCR 方法的建立  46
      3.4.4.3 四环素类耐药基因二重PCR 方法的建立  46-47
    3.4.5 aph(3)-Ⅱa 基因荧光定量PCR 方法的建立  47-52
      3.4.5.1 aph(3)-Ⅱa-1 片段的PCR 扩增  47
      3.4.5.2 pMD-APH 重组质粒的PCR 鉴定  47-48
      3.4.5.3 pMD-APH 重组质粒测序结果与原始序列的比较  48
      3.4.5.4 荧光定量PCR 标准品的建立  48
      3.4.5.5 荧光PCR 引物扩增目的片段的验证  48-49
      3.4.5.6 荧光PCR 检测方法的敏感性试验结果  49
      3.4.5.7 荧光PCR 检测方法的稳定性试验结果  49-50
      3.4.5.8 22 株沙门氏菌质粒aph(3)-Ⅱa 基因荧光定量PCR 鉴定结果  50-51
      3.4.5.9 22 株沙门氏菌基因组DNA 中aph(3)-Ⅱa 基因荧光定量PCR 鉴定结果  51-52
4 讨论  52-56
  4.1 影响不同阶段临床健康猪沙门氏菌带菌率因素  52
  4.2 沙门氏菌分离株血清群分布  52
  4.3 沙门氏菌分离株药物感受性  52-53
  4.4 沙门氏菌分离株Ⅰ 类整合子和耐药基因分布  53-54
  4.5 复合PCR 同时检测多种耐药基因  54
  4.6 荧光定量PCR 方法对aph(3)-Ⅱa 基因的定量检测  54-56
结论  56-57
参考文献  57-65
附录  65-66
致谢  66-67
作者简介  67
在读期间发表论文  67

安徽省部分猪场生猪沙门氏菌带菌情况与耐药性研究

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