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特异性IgY对肠道感染小鼠黏膜免疫的影响

作　者: 王妮
导　师: 徐永平
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 卵黄抗体鼠伤寒沙门氏菌肠道黏膜免疫炎症因子
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

卵黄抗体(Egg Yolk immunoglobulin, IgY)作为具有广阔前景的抗生素替代品,在防治感染性疾病的应用中取得了良好的效果,但对其作用机理的研究还处于初始阶段。本论文运用鼠伤寒沙门氏菌小鼠肠道感染模型,探讨特异性IgY对炎症反应中炎症因子的表达量的影响,考察特异性IgY与黏膜免疫系统的相互作用。本研究考察不同的菌种、小鼠品系、小鼠年龄、抗生素处理及攻毒剂量和持续时间对小鼠肠道感染模型建立的影响。结果表明使用5mg/ml链霉素处理2天后,3×109CFU/ml浓度鼠伤寒沙门氏菌灌胃攻毒4周龄昆明小鼠,连续2天,每天0.4 ml,可致小鼠痉挛、抽搐甚至死亡,死亡率可达60%以上,解剖可观察到肠道黏膜充血肿胀。以上症状明显且可重复,证实模型建立成功。本研究采用灭活的鼠伤寒沙门氏全菌作为抗原免疫蛋鸡制备特异性抗体。采用水稀释-盐析-超滤技术从卵黄中分离纯化IgY,抗体纯度可达90%,回收率为90.6mg/egg。ELISA检测可知,免疫第6周的抗体效价达到最大值,为1：10000。免疫荧光实验表明,病原菌与特异性IgY特异性结合,与非特异性IgY存在部分结合。抑菌实验表明特异性IgY在液体培养基中以剂量依赖方式抑制病原菌的生长,IgY浓度为20 mg/ml时抑菌效果明显。以0.4ml 3×109CFU/ml浓度的菌液灌胃小鼠后,再分别给小鼠灌胃PBS、20 mg/ml特异性IgY、20 mg/ml非特异性IgY和5 mg/ml链霉素溶液,观察10天内小鼠状态和死亡率。攻毒后第5天解剖小鼠,取肠道组织,提取总RNA,用Real-time PCR方法检测肠道组织中炎症因子(IFN-γ、IL-6和IL-10)的表达水平。结果表明,特异性IgY可有效降低鼠伤寒沙门氏菌感染造成的小鼠病症和死亡率,改善肠道病理状态,且小鼠肠道中促炎因子IFN-γ的表达量显著降低,抗炎因子IL-10表达量显著增加(P<0.05)。说明特异性IgY可以降低小鼠肠道感染时的炎症反应。同时IgY还可以增加肠道中IL-6的表达量,该细胞因子具有促进抗体分泌的作用。本研究建立了昆明小鼠的鼠伤寒沙门氏菌肠道感染模型,制备了抗鼠伤寒沙门氏菌的特异性IgY,证实了特异性IgY可降低鼠伤寒沙门氏菌感染造成的死亡率。特异性IgY可以降低促炎因子和提高抗炎因子的表达量,减轻肠道病理症状,降低炎症反应。研究结果为特异性IgY防治感染性疾病机理提供了新的研究方向。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
引言  10-12
1 绪论  12-26
  1.1 IgY的研究进展  12-19
    1.1.1 IgY的分子结构和在抗体进化史中的地位  12-14
    1.1.2 IgY应用的研究进展  14-17
    1.1.3 IgY抑菌机理研究进展  17-19
  1.2 肠道黏膜免疫的研究进展  19-25
    1.2.1 肠道黏膜免疫系统组成  19-23
    1.2.2 肠道黏膜免疫系统的免疫应答  23-25
  1.3 本研究的目的、意义及主要工作  25-26
2 小鼠肠道感染模型的建立  26-33
  2.1 实验材料及设备  26-27
    2.1.1 实验动物  26
    2.1.2 菌种  26
    2.1.3 试剂  26
    2.1.4 仪器设备  26-27
    2.1.5 溶液配制  27
  2.2 实验方法  27-28
    2.2.1 细菌培养和定量  27
    2.2.2 小鼠灌胃攻毒  27-28
    2.2.3 小鼠攻毒后状态观察  28
    2.2.4 统计学分析  28
  2.3 实验结果与分析  28-30
    2.3.1 小鼠生活状态  28-29
    2.3.2 小鼠的腹泻率及稀便级  29-30
    2.3.3 小鼠死亡率  30
  2.4 讨论  30-32
    2.4.1 抗生素处理小鼠肠道对小鼠肠道感染模型建立的影响  31
    2.4.2 不同菌种对小鼠肠道感染的影响  31-32
  2.5 小结  32-33
3 特异性IgY的制备和分离纯化  33-44
  3.1 实验材料及设备  33-36
    3.1.1 实验动物  33
    3.1.2 菌种  33
    3.1.3 试剂  33
    3.1.4 仪器  33-34
    3.1.5 溶液配制  34-36
  3.2 实验方法  36-39
    3.2.1 免疫原制备  36
    3.2.2 蛋鸡免疫和鸡蛋收集  36
    3.2.3 IgY分离和纯化  36-37
    3.2.4 抗体效价检测  37-38
    3.2.5 抗体纯度检测  38
    3.2.6 抗体抑菌效果检测  38-39
  3.3 实验结果与分析  39-41
    3.3.1 抗体效价  39-40
    3.3.2 抗体纯度  40
    3.3.3 抗体抑菌效果  40-41
  3.4 讨论  41-42
    3.4.1 免疫影响因素  41-42
    3.4.2 抗体分离纯化  42
    3.4.3 抗体抑菌活性  42
  3.5 小结  42-44
4 特异性IgY对小鼠肠道感染的保护作用  44-56
  4.1 实验材料和设备  44-45
    4.1.1 实验动物  44
    4.1.2 菌种  44
    4.1.3 试剂  44
    4.1.4 仪器  44-45
    4.1.5 溶液配制  45
  4.2 实验方法  45-49
    4.2.1 动物实验方案  45-46
    4.2.2 小鼠死亡率及肠道病理状态观察  46
    4.2.3 炎症因子检测  46-48
    4.2.4 统计分析  48-49
  4.3 实验结果与讨论  49-53
    4.3.1 小鼠体重及死亡率  49-50
    4.3.2 小鼠肠道病理状态  50-51
    4.3.3 RNA提取结果及单基因片段的克隆  51-52
    4.3.4 引物设计检测和标准曲线制定  52-53
    4.3.5 炎症因子表达量分析  53
  4.4 讨论  53-55
    4.4.1 特异性IgY对小鼠肠道感染保护作用  53-54
    4.4.2 特异性IgY对小鼠肠道炎症因子表达的影响  54
    4.4.3 抗生素对肠道免疫系统的影响  54-55
  4.5 小结  55-56
结论  56-57
参考文献  57-63
附录A 基因序列信息  63-64
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  64-65
致谢  65-66

特异性IgY对肠道感染小鼠黏膜免疫的影响

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