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RNA干扰技术用于流感病毒防治的探索研究

作　者: 侯继业
导　师: 周晓巍
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 遗传学
关键词: RNA干扰 小干扰RNA 流感病毒 病毒复制
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


RNA干涉(RNA interference, RNAi)是上世纪末发现的生物体用来防御外来病毒侵染、防止转座子过度转座、保护基因组的重要手段,通过小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)介导与其互补的mRNA特异性降解。RNAi从发现开始就受到病毒研究学者的高度重视,被认为是潜在的抗病毒感染的有效方法之一,现已经广泛用于抗病毒的研究,包括人类免疫缺陷病毒I型、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒、脊髓灰质炎病毒、口蹄疫病毒以及呼吸道合胞病毒等等。流感病毒是单股负链分节段RNA病毒,在其复制周期中有vRNA、cRNA和mRNA,都可作为RNA干扰的靶分子。本研究的目的是探索RNA干扰技术用于流感病毒防治的可能性。首先采用质粒载体表达了3种针对流感病毒m基因的shRNA型siRNA,通过Real-time PCR和Western blotting检测,发现3种siRNA均可在mRNA水平有效降低靶蛋白的表达,而且可以抑制流感病毒其它蛋白的表达,抑制效率最高的达到60%以上,说明这三种针对m基因的siRNA对流感病毒的复制具有一定作用。为了获得抑制效率更高的靶点,我们采取化学合成的方法合成了分别针对pa基因、np基因和m基因的4种siRNAs,直接转染细胞,通过Real-time PCR检测对靶基因表达的抑制作用以及对非靶基因的影响,结果显示针对不同靶点的4种siRNAs同样不仅抑制了靶基因的表达,也抑制了非靶基因的表达,尤其是当同时转染4种siRNA时抑制效率达到最高,即通过多靶点同时作用获得了更好的抑制效果。鉴于上述siRNA的抑制效果均不理想,考虑到合理设计的局限性,我们探索了利用基于流感病毒基因组的siRNA文库筛选抑制效率高的靶点的可能性。将流感病毒的8个基因与tk基因和puro基因融合克隆到表达载体,重组质粒转染细胞构建稳定表达细胞株,建立了用于筛选文库的tk-puro-v融合基因筛选系统;体外转录获得流感病毒基因组dsRNA,经RNaseIII切割获得20-22bp siRNA,插入到已经构建的表达文库siRNA的双启动子型表达载体。文库的鉴定和筛选工作有待进一步开展。本研究获得了多个能抑制流感病毒复制的siRNA,在构建基于病毒基因组的siRNA文库方面进行了有益的尝试,为探索RNA干扰技术用于流感病毒的防治搭建了很好的技术平台,奠定了良好的工作基础。

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 基因工程的应用
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