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siRNA沉默类肝素酶基因的表达对人前列腺癌细胞恶性生物行为学的影响

作 者: 罗兵锋
导 师: 曾甫清
学 校: 华中科技大学
专 业: 外科学
关键词: 前列腺癌 类肝素酶 小干扰RNA
分类号: R737.25
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 3次
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内容摘要


目的:类肝素酶(Heparanase HPSE)是一种能够在某些限制性的位点裂解硫酸乙酰肝素(heparan sulfate HS)的一种内β-D葡萄糖醛酸酶.由于其参与了细胞外基质(extracellular matrix ECM)和基底膜(basement membrane BM)的降解和重塑,因此被认为在肿瘤细胞的侵袭、转移以及肿瘤的血管形成等方面起着非常重要的作用。我们利用靶向类肝素酶基因沉默的小干扰RNA(small interference RNA siRNA)来探讨抑制该基因的表达对前列腺癌细胞恶性生物学行为的影响、Argonaute蛋白在RNA干扰(RNA interference RNA i)中的作用及HPSE对血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9 MMP-9)的调控关系。方法:人前列腺癌细胞株PC3高表达类肝素酶基因和Argonaute基因。我们针对人的类肝素酶mRNA序列合成了四对小干扰RNA,针对人的Argonaute mRNA的序列合成了两对小干扰RNA,利用脂质体Lipofectemine2000做为载体将siRNAs转染PC3细胞。反转录聚合酶链反应(RT-PCR),实时定量反转录聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)蛋白质免疫印迹(Western blot)来检测类肝素酶和Argonaute基因被siRNA沉默后mRNA和蛋白质的表达水平。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、克隆形成实验、细胞粘附实验、细胞Transwell侵袭实验和血管形成实验分别检测对PC3细胞的增殖、粘附、侵袭和血管生成的影响。结果:与空白组相比,转染了靶向HPSE-siRNA的HESP基因mRNA和蛋白质表达水平显著下降,抑制HPSE基因表达的作用时间于转染后24~96小时,癌细胞的增殖、侵袭、转移和血管生成能力均受到明显抑制。此外,靶向抑制Argonaute-1(AGO-1)和Argonaute-2(AGO-2)基因表达可逆转HPSE-siRNA组的HESP基因表达的抑制,这表明AGO-1和AGO-2参与了siRNA介导的转录后基因沉默的途径之中。与此同时,我们还在实验中发现,在HPSE-siRNA组中,HPSE基因表达的抑制还可导致与肿瘤密切相关的血管内皮细胞生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的mRNA和蛋白质表达的明显下调。结论:靶向沉默HESP基因的表达可显著抑制人前列腺癌细胞PC3体外的侵袭、转移和血管生成的能力。靶向类肝素酶(HPSE)基因沉默的siRNA具有治疗前列腺癌的潜在应用价值。AGO-1和AGO-2基因参与了siRNA介导的转录后基因沉默途径之中,并是RNA干扰(RNA interference RNAi)发挥有效作用不可或缺的重要组成部分。此外siRNA靶向HPSE基因的沉默将导致VEGF和MMP-P表达的下调,这表明HPSE积极参与了对VEGF和MMP-9基因的调控。

全文目录


中文摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-14
  参考文献  12-14
第一部分 人前列腺癌细胞高表达 HPSE 基因及转染靶向 HPSE-siRNA 对HPSE 基因表达的影响  14-26
  材料和方法  14-21
  结果  21-23
  讨论  23-25
  参考文献  25-26
第二部分 siRNA 沉默类肝素酶基因的表达可抑制人前列腺癌细胞 PC3 的恶性生物学行为特性  26-37
  材料和方法  26-28
  结果  28-33
  讨论  33-35
  参考文献  35-37
第三部分 Argonaute 蛋白参与靶向 HPSE-siRAN 的 RNAi 途径之中及HPSE 对 VEGF 和 MMP-9 表达的调控  37-46
  材料和方法  37-38
  结果  38-40
  讨论  40-44
  参考文献  44-46
综述  46-56
  参考文献  52-56
致谢  56-58
附录  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 男性生殖器肿瘤 > 前列腺肿瘤
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