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靶向MIF的siRNA对大肠癌生长与荷瘤小鼠生存质量的影响

作　者: 王亚敏
导　师: 何兴祥
学　校: 广东药学院
专　业: 消化内科学
关键词: 巨噬细胞移动抑制因子血管内皮生长因子小干扰RNA Caspase-3 细胞凋亡结肠肿瘤
分类号: R735.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景与目的:巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration Inhibitory Factor,MIF)是一种多功能的细胞因子,由垂体前叶、T淋巴细胞和单核/巨噬细胞分泌。MIF有多种生物学功能:⑴MIF的主要功能是激活T淋巴细胞,刺激B淋巴细胞产生抗体,导致炎症的发生,促进肿瘤的发生、发展;⑵MIF是炎症反应中最重要的介质。当组织损伤和感染时,LPS或α-TNF可诱导MIF的释放,参与组织损伤修复;⑶MIF具有神经内分泌功能,负反馈调节垂体激素和糖皮质激素;⑷MIF具有多种酶活性,如多巴色素异构酶、羟苯丙酮酸异构酶和蛋白质-巯基氧化还原酶等。近年来MIF在肿瘤发生、发展、侵袭及转移中的作用备受关注,其可能的作用机制是MIF上调VEGF、TNF-β、PDGF表达,促进肿瘤血管生长、侵袭和转移;MIF作用于PKC、MAPK、ERK1/2、c-jun、Jab、CSNS、P27等细胞信号转导途径,参与细胞增殖[8];MIF抑制P53依赖的细胞凋亡,致使细胞凋亡减少;MIF抑制NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用;MIF促进癌基因表达,如N-myc、C-fas等。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种高效、特异的基因沉默手段,是将dsRNA导入细胞,引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程。小干扰RNA(small interfering RNA , siRNA)是RNAi的效应分子,与目的基因mRNA的同源序列互补结合,导致整条mRNA失去翻译蛋白质的功能。MIFsiRNA是化学合成的靶向MIF的特异性siRNA,能够与MIFmRNA同源序列特异性的结合,导致MIFmRNA序列分解,失去翻译成MIF蛋白质的功能。本课题旨在分析瘤内注射MIFsiRNA对大肠癌生长与荷瘤小鼠生存质量的影响,并探讨其可能的作用机制,为大肠癌的治疗开辟新途径。方法:利用盲肠造疝原位接种瘤块法建立大肠癌动物模型。将成功建模后的小鼠随机分为3组,每组10只,每周2次分别注射DEPC水、MIFsiRNA(0.15nmol/g)和非特异性siRNA(0.15nmol/g)瘤内干预,每天称量各组小鼠饮水、饮食量和体重,每周测量1次肿瘤体积。干预4周后处死小鼠,称取肿瘤重量,用ELISA法检测小鼠血清中MIF和VEGF水平,用免疫组织化学法检测小鼠组织中MIF水平,分光光度法检测肿瘤组织中Caspase-3蛋白的表达,TUNEL法检测肿瘤组织中凋亡细胞数。结果:MIFsiRNA干预组小鼠血清中MIF表达比其他两组低〔(22±6)ng/ml vs(32±8)ng/ml and (33±8)ng/ml,P<0.01〕,小鼠血清中VEGF表达比其他两组低〔(1.367±0.078)ng/ml vs(1.792±0.145)ng/ml and (1.892±0.144)ng/ml,P<0.01〕,组织中MIF阳性细胞数比其他两组少〔(85±20)/500个vs(423±23)/500个and (442±31)/500个,P<0.01〕;建模后24-31d MIFsiRNA干预组小鼠肿瘤体积均明显小于其他两组(P<0.01),处死后肿瘤重量也明显轻于其他两组〔(1.93±0.21)g vs (4.40±0.30)g and (5.25±0.44)g, P<0.01〕;建模后15～31d饮水量较其他两组多(P<0.01),建模后8～31d饮食量也较其他两组大(P<0.01),三组小鼠体重变化无统计学意义(P>0.05);MIFsiRNA干预组小鼠肿瘤组织中Caspase-3蛋白表达比其他两组高〔(0.74±0.06)μg vs (0.57±0.08)μg and (0.56±0.02)μg,P<0.01〕,凋亡细胞数较其他两组多〔(12±2)?100个vs 0 and 0,P<0.01〕。结论:敲低MIF基因表达可以抑制大肠癌的生长,提高荷瘤小鼠的生存质量,其可能的作用机制是激活Caspase-3促进细胞凋亡;通过下调VEGF表达抑制肿瘤血管生成。

全文目录

中文摘要  7-10
Abstract  10-13
前言  13-18
  1. 立题依据  13-16
  2. 研究思路  16-18
材料和方法  18-38
  1. 材料  18-26
    1.1 实验动物  18
    1.2 细胞系  18
    1.3 主要试剂  18
    1.4 试剂配制  18-23
    1.5 siRNA  23
    1.6 抗体  23
    1.7 试剂盒  23-24
      1.7.1 TUNEL 试剂盒组分  23-24
      1.7.2 BCA 蛋白浓度测定试剂盒  24
      1.7.3 凯基 Caspase-3 分光光度法检测试剂盒  24
    1.8 主要仪器  24-26
  2. 方法  26-37
    2.1 细胞培养  26-28
    2.2 大肠癌模型的建立  28-29
    2.3 转染结果的验证  29
    2.4 动物的分组及处理  29-30
    2.5 ELISA 法测定血清中MIF、VEGF 水平  30-32
    2.6 免疫组化法测定MIF 蛋白表达  32-35
    2.7 检测Caspase-3 蛋白表达量  35-36
    2.8 TUNEL 凋亡试剂盒测定细胞凋亡  36-37
  3. 统计方法  37-38
实验结果  38-48
  1. 大肠癌模型的建立结果  38
  2. FAM-siRNA 转染大肠癌后冰冻切片结果  38-39
  3. MIFsiRNA 治疗后小鼠的饮食饮水量增加  39
  4. MIFsiRNA 治疗后小鼠的体重没有显著增加  39-40
  5. MIFsiRNA 抑制盲肠移植瘤体积增长  40-41
  6. MIFsiRNA 抑制盲肠移植瘤重量增加  41-42
  7. ELISA 法检测MIFsiRNA 对血清中MIF 蛋白表达的影响  42-43
  8. ELISA法检测MIFsiRNA对血清中VEGF 蛋白表达的影响  43-44
  9. 免疫组化法检测MIFsiRNA 对肿瘤组织中MIF 蛋白表达的影响  44-46
  10. 分光光度法检测MIFsiRNA 对Caspase-3 表达影响  46
  11. TUNEL 法检测MIFsiRNA 对肿瘤细胞凋亡的影响  46-48
讨论  48-51
参考文献  51-58
全文小结  58-59
攻读学位期间发表论文  59-60
缩略语表  60-61
致谢  61

靶向MIF的siRNA对大肠癌生长与荷瘤小鼠生存质量的影响

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