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新型渔用基因工程菌蜕疫苗的研制

作　者: 侯贤
导　师: 杨桂文；安利国
学　校: 山东师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 菌蜕疫苗豚鼠气单胞菌基因工程
分类号: S948
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 49次
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内容摘要

菌蜕(Bacterial ghosts,BGs)是没有内容物的完整细菌外壳。通过PhiX174溶菌基因E的表达在革兰氏阴性菌细胞膜表面形成跨膜孔道,导致细菌内容物的丢失,形成菌蜕。菌蜕形成过程不引起细胞表面其他结构的理化变化,因此它能够保持与活菌细胞膜相似的形态、黏附性、细菌表面抗原等特性,可以有效诱导机体的体液、细胞免疫应答及增强粘膜免疫反应。本实验以菌蜕为基础,拟制备出安全、高效的渔用基因工程疫苗。根据噬菌体PhiX174溶菌基因E的序列,设计含有EcoR I、Sal I酶切位点的引物。利用PCR技术扩增出E基因片段,连接到pMD18-T载体上,构建了克隆载体pT-E。测序发现E基因第20位碱基发生了致死突变,因而导致E基因不能正常表达。根据突变位点的位置,通过延长引物序列修正突变位点,从而得到了正确的溶菌基因E序列。将其连接到具有温控表达系统cI857-PR/PL的表达载体pBV220上,成功构建了氨苄青霉素抗性溶菌质粒pBV-Elysislysis。将溶菌质粒转化入大肠杆菌DE3,使用氨苄青霉素筛选出阳性克隆。当含有溶菌质粒的大肠杆菌在28℃生长到对数期,OD600约为0.3时,通过升高温度至42℃诱导E基因表达。诱导开始后,每20min取样测定菌液吸光度,并取菌液涂布培养,检测活菌数量。诱导20min后,E基因表达明显,菌液吸光度开始下降。随着诱导时间延长,菌液吸光度缓慢降低至平衡,活菌数迅速下降。诱导3h后溶菌完全,得到了大肠杆菌菌蜕,溶菌效率达到100%。溶菌质粒转化入野生鞘氨醇假单胞菌,诱导0.5h后开始溶菌,诱导7h后溶菌效率达99.994±0.005%。经扫描电镜观察,可以看到明显的溶菌孔道。由于近些年来抗生素的滥用,导致了多数水生致病菌对氨苄青霉素均不敏感,转化后很难筛选出正确的阳性克隆,因此本实验又进一步构建了具有庆大霉素抗性的广宿主溶菌质粒pBM-C-Elysis。构建的广宿主质粒仍然采用温控表达系统cI857-PR/PL实现E基因的可调控表达。根据温控溶菌盒和广宿主载体pBBR-MCS-5的序列,设计含有BamH I、Xho I酶切位点的引物,利用PCR技术扩增出温控溶菌盒,直接双酶切后连接到经过相同酶切的pBBR-MCS-5载体上,成功构建了具有庆大霉素抗性的广宿主溶菌质粒pBM-C-Elysis。将溶菌质粒转化入大肠杆菌DE3表达菌中,28℃扩大培养大肠杆菌至对数生长期,OD600约为0.4时,开始升高温度至42℃。热诱导40min后,开始溶菌,菌液吸光度有所降低。诱导2h后,菌液吸光度基本保持稳定;热诱导40min后,活菌数迅速降低;诱导4h后溶菌效率为99.9999±0.0001%。溶菌质粒转化入野生豚鼠气单胞菌中,热诱导1h后,菌液吸光度开始下降并趋于平稳;诱导1h后,活菌数迅速降低;诱导5h后,溶菌效率达99.9997±0.0003%,低压冷冻干燥后无活菌。扫描电镜下可观察到明显的溶菌孔道,并且溶菌孔道只占细菌表面很少一部分,其他结构并未受到破坏。豚鼠气单胞菌能够引起多种鱼类疾病。将制备的豚鼠气单胞菌菌蜕疫苗腹腔注射免疫鲤鱼,二次免疫2周后取血,分离血清测定抗体效价。通过凝集反应测定免疫3周后,血清抗体效价为640。本文以菌蜕为基础,成功构建了两套溶菌系统:氨苄青霉素抗性溶菌质粒和庆大霉素抗性广宿主溶菌质粒。分别在鞘氨醇假单胞菌和豚鼠气单胞菌中诱导溶菌,通过测定菌液吸光度、活菌数检测、扫描电镜观察,成功制备了这两种野生致病菌的菌蜕疫苗。为渔用基因工程疫苗的发展提供了平台。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-10
第一章综述  10-17
  1 菌蜕研究  10-13
  2 菌蜕优势  13-14
  3 菌蜕在鱼类致病菌中的应用  14-16
  4 豚鼠气单胞菌概况  16
  5 研究意义  16-17
第二章氨苄青霉素抗性溶菌质粒的构建  17-36
  1 实验材料  17-19
  2 实验方法  19-26
  3 实验结果  26-34
  4 讨论  34-36
第三章庆大霉素抗性广宿主溶菌质粒的构建  36-50
  1 实验材料  36
  2 实验方法  36-41
  3 实验结果  41-48
  4 讨论  48-50
结论  50-51
参考文献  51-56
致谢  56-57
攻读硕士学位期间发表文章  57

新型渔用基因工程菌蜕疫苗的研制

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