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大豆生物种衣剂的研制与应用

作　者: 朱文静
导　师: 高学文
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 生物种衣剂基因工程芽孢杆菌大豆根腐病生物防治
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

芽孢杆菌(Bacillus spp.)是一种嗜热、好氧的G+杆状细菌,该菌分布广泛,其能产生抗逆性强的芽孢、多种抗生素和酶类物质,是目前生防细菌中研究和应用较多的一类细菌。HpaGxooc是由水稻细条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola)产生的一种非特异性蛋白激发子,属于harpin蛋白家族。HpaGxooc能激发非寄主植物的过敏性细胞坏死,诱导植物抗虫、抗病、抗旱,促进植物生长。在本研究中,为了进一步提高芽孢杆菌的防病促生性能,获得更好的生防效果,我们利用基因工程的方法将HpaGxooc编码基因转入到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)69菌株中,构建出基因工程菌株69HF,并分别以69和69HF的发酵液为活性成分进行生物种衣剂的研制与应用。我们对种衣剂的各种助剂进行了筛选,结果表明,4%聚乙烯醇和4%壳聚糖以8：2的比例混合配制而成的复合成膜剂,结合了聚乙烯醇和壳聚糖的优点,具备良好的成膜性、耐水性、溶胀性、透气性和透水性,而且对生防菌的存活没有不良影响,因此为最佳成膜剂；0.5%山梨酸钾不但防腐性能好,而且对生防菌的存活无不良影响,为最佳防腐剂；5%丙二醇防冻性能优良,对生防菌的存活也无不良影响,是最佳防冻剂。利用生防菌69HF发酵液和筛选出的各种最佳助剂制备出生物种衣剂,并对种衣剂的有效成分含量、pH、粘度、热贮后活菌下降率以及室温贮藏一年内种衣剂中菌浓度的变化等进行了测定。结果表明,生物种衣剂中69HF的初始含量为5.0×108-8.0×108 cfu/ml,生物种衣剂的pH值偏酸性,粘度为255 mPa·s,热贮后活菌下降率为40.21%。在室内自然放置一年的时间内,种衣剂中的活菌量保持在较高浓度,在第12个月时,种衣剂中的含菌量为即5.34×106 cfu/ml。分别通过大豆室内沙培和温室盆栽实验对生物种衣剂的防病促生效果进行了测定。实验结果表明,由69HF和69制备的生物种衣剂有促进大豆生长和防治大豆根腐病的作用,且促生防病效果要好于化学种衣剂咯菌腈,而由工程菌69HF制备的种衣剂在对大豆的防病促生方面要显著的好于由69制备的种衣剂。在温室盆栽条件下,由工程菌69HF制备的种衣剂包衣的大豆的株高、鲜重和根长相比未包衣的对照处理分别增加了67.94%、73.79%和63.84%,对大豆根腐病的防治效果达到85.89%。说明将HpaGxooc编码基因转化B. subtilis 69得到的基因工程菌株69HF能够更好的防治植物病害和促进植物生长,在农业生产上有着巨大的应用潜力。此外,在本研究中,我们还选择20株从西藏地区植物根际土壤分离鉴定的有生防潜力的芽孢杆菌,通过平板抑菌实验,筛选出11株对大豆根腐病病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)拮抗效果好的菌株,并利用这些菌株的发酵液作为活性成分,添加一定比例在前面实验筛选出的各种最佳助剂,制备出不同的生物种衣剂。为筛选出对大豆生长有促进作用的生物种衣剂,进行了大豆的室内沙培实验,结果表明,由萎缩芽孢杆菌(B. atrophaeus) LSSC3和枯草芽孢杆菌(B. subtillis) SYST2制备的种衣剂对大豆发芽及生长都有显著促进作用,其他菌株制备的种衣剂对大豆的生长没有显著的影响。用这两种生物种衣剂对大豆进行温室盆栽实验,结果表明,在接种病原菌的条件下,由两种衣剂包衣的大豆的株高、鲜重、主根长等都显著的高于化学种衣剂包衣和未包衣处理,同时对大豆根腐病也起到了很好的防治作用,防效分别达到72.38%和73.69%。

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摘要 6-8ABSTRACT 8-11文献综述 11-32 第一章大豆根腐病简介 12-20 1 大豆根腐病的病原菌 12-14 1.1 病原菌种类 12-13 1.2 主要病原菌的生物学特性 13-14 1.3 病原菌的寄主范围 14 2 大豆根腐病的症状 14-15 3 大豆根腐病侵染循环及发病因素 15-17 3.1 侵染循环 15-16 3.2 影响发病的因素 16-17 4 大豆根腐病的防治 17-20 4.1 抗病耐病品种的选育 17 4.2 农业栽培措施 17-18 4.3 化学防治 18 4.4 生物防治 18-20 第二章种衣剂研究进展 20-32 1 种衣剂的组成 20-24 1.1 种衣剂主要的活性成分 20-22 1.2 种衣剂主要的非活性成分 22-24 2 种衣剂的分类 24-26 2.1 按应用范围分类 24-25 2.2 按剂型分类 25 2.3 按功能分类 25-26 3 种衣剂发展概况 26-28 3.1 国外种衣剂的发展 26-27 3.2 国内种衣剂的发展 27-28 4 生物种衣剂概述 28-32 4.1 生物种衣剂的研究开发概况 28-29 4.2 芽孢杆菌在生物种衣剂中的应用 29-30 4.3 生物种衣剂的优点与不足 30-32研究内容 32-67 第一章枯草芽孢杆菌基因工程菌大豆生物种衣剂的研制与应用 33-57 1 材料与方法 35-45 1.1 供试菌株和质粒 35 1.2 供试大豆品种 35 1.3 培养基 35-37 1.4 试剂 37 1.5 试验仪器 37 1.6 枯草芽孢杆菌69菌株的转化 37-40 1.7 生物种衣剂助剂的筛选 40-43 1.8 生物种衣剂的制备以及各项指标的测定 43-44 1.9 种衣剂防病促生试验 44-45 2 结果与分析 45-55 2.1 枯草芽孢杆菌转化 45-46 2.2 生物种衣剂助剂的筛选 46-52 2.3 生物种衣剂各项指标的测定 52-53 2.4 种衣剂对大豆的防病促生试验 53-55 3 讨论 55-57 第二章西藏地区分离的芽孢杆菌生物种衣剂的应用 57-67 1 材料与方法 59-62 1.1 供试菌株 59 1.2 大豆品种 59 1.3 培养基 59-60 1.4 试剂 60 1.5 试验仪器 60 1.6 尖孢镰刀菌拮抗菌株的筛选 60-61 1.7 生物种衣剂的制备 61 1.8 室内沙培实验 61 1.9 温室盆栽实验 61-62 2 结果与分析 62-65 2.1 尖孢镰刀菌拮抗菌株的筛选 62-63 2.2 室内沙培实验 63-65 2.3 生物种衣剂对大豆的温室防病促生实验 65 3 讨论 65-67参考文献 67-75致谢 75-76攻读硕士学位期间发表的论文 76

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