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东亚钳蝎镇痛肽Ⅳ的分离纯化、基因克隆及表达

作　者: 杨倬
导　师: 张景海
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 蝎毒分离纯化镇痛活性肽克隆表达
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

蝎毒是一种名贵中药，具有重要临床价值，其作用主要有以下几个方面：抗肿瘤、镇痛、抗惊厥、抗癫痫、降血压及抗血栓形成等作用。本论文主要关注蝎毒的镇痛活性。研究证明蝎毒对躯体痛和内脏痛均有较强的抑制作用，相比较传统的用于临床的镇痛药物具有镇痛强度高、起效快、无成瘾性等优点。本文采用各种层析手段共经过五步柱层析，从东亚钳蝎毒中分离纯化出一种镇痛活性肽Ⅳ（SAPⅣ）。SAPⅣ经SDS-PAGE、反相离子对高效液相色谱及高效毛细管电泳三种方法鉴定已达电泳纯和色谱纯；用SDS-PAGE法测得它的分子量为7.4kDa；用等电聚焦法测得它的等电点为8.33；SAPⅣ在274.8nm处有紫外最大吸收峰。用小鼠醋酸扭体法和热板法实验进行药理活性测定，结果表明SAPⅣ对小鼠躯体痛和内脏痛均有抑制作用。在剂量为0.1mg／kg小鼠体重时，SAPⅣ对由醋酸引起的小鼠扭体反应抑制率为64.3％。在热板反应模型中，SAPⅣ仍按照0.1mg／kg小鼠体重给药，15分钟时小鼠在热板上痛阈提高最大值为138％。用Edman降解法测定东亚钳蝎毒镇痛活性肽SAPⅣ的N末端17个氨基酸序列。以蝎毒RNA-cDNA复合物为模板，PCR扩增得到SAPⅣ成熟肽的cDNA并克隆至表达载体pET-28a中，测序结果显示SAPⅣ碱基序列长198bp，该序列编码66个氨基酸。序列的同源性分析表明SAPⅣ与类alpha神经毒素有高度同源性作用于Na⁺通道。将构建好的pET-28a-SAPⅣ表达质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）进行IPTG诱导表达，表达产物为SAPⅣ-L-E-his₆，多以包涵体的形式存在。然后将SAPⅣ克隆至表达载体pSYPU-1b中，构建表达质粒pSYPU-1b-SAPⅣ，表达产物为SAPⅣ-his₆，可溶性表达。

全文目录

中文摘要  8-9
英文摘要  9-11
前言  11-23
第一章东亚钳蝎镇痛肽Ⅳ的分离纯化、活性筛选及部分性质  23-43
  一、实验材料  23-24
  二、实验方法  24-29
    1.蛋白质含量测定  24-25
    2.镇痛活性筛选  25
    3.不连续-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  25-27
    4.分离纯化  27
    5.纯度鉴定  27-28
    6.部分性质测定  28-29
  三、实验结果  29-40
  四、讨论  40-42
  五、小结  42-43
第二章东亚钳蝎镇痛肽Ⅳ的基因克隆与表达  43-63
  一、实验材料  43
  二、实验方法  43-52
    1.SAPⅣ的N末端部分氨基酸序列测定  43
    2.琼脂糖凝胶电泳  43-44
    3.质粒小量制备  44
    4.热转化大肠杆菌感受态细胞  44-45
    5.SARⅣ的基因克隆  45-48
    6.编码SAPⅣ成熟肽核酸及蛋白序列分析  48-49
    7.重组质粒pET-28a-SAPⅣ的诱导表达  49
    8.重组质粒pSYPU-1b-SAPⅣ的构建  49-52
    9.重组质粒pSYPU-1b-SAPⅣ的诱导表达  52
  三、实验结果  52-61
  四、讨论  61-62
  五、小结  62-63
结论  63-64
参考文献  64-68
致谢  68

东亚钳蝎镇痛肽Ⅳ的分离纯化、基因克隆及表达

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