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荧光定量PCR检测急性髓系白血病骨髓细胞多基因表达及其临床意义

作　者: 黄走方
导　师: 孟凡义
学　校: 南方医科大学
专　业: 内科学
关键词: 实时荧光定量PCR 急性髓系白血病基因预后
分类号: R733.71
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景与目的:急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种异质性髓细胞肿瘤,目前标准化疗可以获得70%—80%的完全缓解（complete remission,CR）率,但大部分CR后的患者终将复发,甚至一部分患者难以达到CR而成为难治性白血病,治疗无效而死亡。目前对AML的预后判断主要根据患者年龄、外周血白细胞计数和染色体核型等指标。但即使在核型完全正常的患者的预后也不尽相同。因此,寻找在判断预后的敏感性指标具有重要意义。近年来,从基因水平上研究预后棚关的指标已成为热点,并且展现了有意义的前景。本课题组前期工作用高通量基因芯片技术,研究了首次完全缓解持续时间相差显著的AML M2a亚型患者之间的基因表达谱差异,筛选出差异表达的基因22个。其中GGTLA1、FAM3A等基因在完全缓解持续时间短的3例患者中表达均上调4倍以上,PDCD7、CGI135、CA6、KIAA1872、KLRF1、APP等基因在上述3例患者中表达均下调4倍以上。因基因芯片仅是定性而非定量分析,且病例数少,仅局限于一个亚型,需要进一步明确它们在AML中的临床意义。实时荧光定量RCR法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点。本研究采用了SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量PCR,反应时设定熔解曲线分析用于区分特异产物和非特异性产物、引物二聚体,保证实验数据的可信性,可以很好的检测患者的基因表达水平。依据本课题组曾应用基因芯片检测AML M2a亚型患者所获得的初步结果,本研究通过生物信息学分析筛选了可能有价值的PDCD7、GGTLA1、FAM3A、KIAA1872、CGI135、KLRF1、APP、CA6、Ang29个基因,应用实时荧光定量RCR技术检测其在初诊AML患者骨髓细胞表达及其临床意义,旨在寻找预后不良指标用于早期诊断难治性白血病及其治疗靶点。方法:1.研究对象:77例新诊断的AML患者均符合当前公认的诊断标准。对照组为年龄、性别匹配的非恶性血液病患者20例。2.引物设计与合成:根据GeneBank的序列设计PDCD7、KLRF1、APP、CGI135、FAM3A、KIAA1872、CA6、GGTLA1、Ang2各基因及管家基因β-actin引物。3.按常规方法获取研究对象的骨髓单个核细胞,提取总RNA,逆转录成cDNA,进行实时荧光定量PCR。通过熔解曲线确定PCR产物的特异性。取两管平均Ct值计算2^-ΔCT值,作为各标本mRNA的相对表达量,ΔCT=（目的基因CT值-内参基因CT值）。4.应用SPSS13.0统计软件分析数据,计量资料呈非正态分布,用中位数描述;两组计量资料间分布比较用Mann-Whitney U test;两变量间相关分析采用Spearman rank correlation analysis;率的比较采用chi-square test;生存分析用Kaplan-Meier曲线;单因素分析及多因素分析用Cox Regression;检验水准α=0.05,双侧检验。结果1.RNA、cDNA纯度和质量分析:所提取总RNA、cDNA经紫外分光光度计检测,比值在1.8～2.0之间。2.同一标本cDNA经2倍比稀释后,设6个梯度,测各梯度浓度,范围是8.1～258.8ng/μl,分别对管家基因和目的基因进行扩增,6个梯度的ΔCT相差很小,说明在浓度范围内管家基因与目的基因的扩增效率一致,其CT值可以反应扩增基因的丰度。扩增后进入熔解程序后生成熔解曲线,熔解曲线显示锐利的单一峰,说明扩增产物均一,无非特异扩增及引物二聚体。琼脂糖凝胶电泳显示各基因所扩增片段条带单一,无引物二聚体和非特异性扩增。3.基因表达:PDCD7、GGTLA1、FAM3A、KIAA1872、CGI135、KLRF1、APP、CA6、Ang29个基因在初诊AML组的表达率分别是:100%、97%、98%、99%、100%、100%、100%、66%、100%,在非恶性血液病组的表达率分别是:100%、90%、100%、100%、100%、100%、100%、75%、100%。发现PDCD7、Ang2基因表达水平在AML组显著高于非恶性血液病组（Z=-2.380,P=0.017;Z=-2.849,P=0.004）,KLRF1基因表达水平在AML组显著低于非恶性血液病组（Z=-2.401,P=0.016）,其余基因在两组间比较无统计学意义（P＞0.05）。4.基因表达水平与临床的关系:将PDCD7等9基因的表达水平与患者初诊时年龄、血红蛋白水平、白细胞计数、血小板计数、乳酸脱氢酶水平和外周血白血病细胞比例及骨髓白血病细胞比例、是否表达CD34、是否表达CD117等指标做相关性分析,结果显示FAM3A与血红蛋白水平呈负相关（r=-0.257,P=0.038）,Ang2与乳酸脱氢酶水平呈正相关（r=0.452,P=0.000）,与白细胞数呈正相关（r=0.566,P=0.000）,与外周血白血病细胞比例呈正相关（r=0.251,P=0.035）。其余均未发现有显著性相关（P＞0.05）。5.基因表达水平与疗效的关系:因分子靶向治疗使M3患者的疗效明显优于其它亚型,分析疗效时将3例M3病例排除。依据各个基因表达的中位数水平为界将患者各分成两组,高于中位数者定义为高表达组,低于中位数者定义为低表达组,各计37例。74例患者中有22例因不足1疗程死亡或2疗程内失访,未列入随访生存之外,其余病例均列入与难治性白血病、治疗反应和生存关系的分析。（1） PDCD7:高表达组24例,低表达组28例。在PDCD7高、低表达组中分别有难治性AML患者14例（58.3%）和10例（35.7%）,二者比较差异无显著性（χ²=2.660,P=0.103）。48例患者随访1年以上,在高表达组22例中1年内死亡12例（54.5%）;低表达组26例中1年内死亡6例（23.1%）。在高表达组的死亡率明显高于低表达组（χ²=5.035,P=0.025）。（2）CGI135:高表达组25例,低表达组27例。二组中分别有难治性AML患者病例15例（58.6%）和9例（32.0%）,二组比较差异无显著性（χ²=1.997,P=0.158）。随访1年以上者在高表达组25例中1年内死亡13例（52.0%）,低表达组23例中1年内死亡5例（21.7%）。在高表达组的死亡率明显高于低表达组（χ²=4.680,P=0.028）。（3） Ang2:高表达组29例,低表达组23例,难治病例分别有18例（62.1%）和6例（26.1%）,在高表达组明显高于低表达组（χ²=6.682,P=0.010）。52例AML患者中有48例随访1年以上,其中高表达组1年内死亡16例（55.2%）,低表达组1年内死亡3例（10.5%）。Ang2高表达组死亡率明显高于低表达组（χ²=9.763,P=0.002）。（4）分析其余6基因与难治AML发生率及预后的关系,未发现有显著性差异（P＞0.05）。（5）以治疗反应及生存时间不同将AML患者分成非难治性AML与难治性AML、首疗程CR与首疗程NR、1年内存活与1年内死亡,比较各组AML患者的各基因表达水平,发现PDCD7在难治性AML组均显著高于非难治性AML组（P＜0.05）,PDCD7、FAM3A、CGI135、Ang2在首疗程NR组均显著高于首疗程CR组（P＜0.05）,PDCD7、Ang2、CA6在1年内死亡组显著高于1年内存活组（P＜0.05）。各组在其余基因的比较中未见显著性差异。结论:1.所提取RNA、cDNA纯度高、质量好,可用于后续实验。2.所设计的各基因引物特异性好,与管家基因扩增效率一致。3.在研究的9个基因中,PDCD7、Ang2基因表达水平在新诊断的AML组明显高于非恶性血液病组,其余7基因在两组间比较无统计学意义。4.将各基因表达水平与患者初诊时年龄、血红蛋白水平、白细胞计数、血小板计数、乳酸脱氢酶水平和外周血白血病细胞比例及骨髓白血病细胞比例、是否表达CD34、是否表达CD117等指标做相关性分析发现,FAM3A与血红蛋白水平呈负相关,Ang2与乳酸脱氢酶水平、白细胞数、外周血白血病细胞比例呈正相关。其余均无显著性相关。5.AML患者骨髓单个核细胞高表达PDCD7、CGI135、Ang2基因可能与治疗反应差、预后不良有关。PDCD7、CGI135、Ang2基因表达水平可能作为评估治疗反应与预后的指标。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-15
前言  15-17
研究对象  17-20
  1.1 研究对象  17-18
  1.2 主要试剂  18
  1.3 主要器材  18
  1.4 液体配制  18-20
方法  20-24
结果  24-43
讨论  43-49
结论  49-50
参考文献  50-58
在研期间学术成果  58-68
英文缩略词表  68-69
致谢  69-71
统计学证明  71

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