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二化螟温州种群Cry1Ab抗性基因频率的F2检测及氨肽酶N基因CsAPN3的克隆
作 者: 侯雪水
导 师: 吴益东
学 校: 南京农业大学
专 业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 二化螟 F2筛选 抗性等位基因频率 氨肽酶N Cry1Ab
分类号: S435.112.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
二化螟Chilo suppressalis(Walker)是我国水稻上一种重要害虫,目前主要依靠化学杀虫剂进行控制。转Bt基因抗虫水稻(Bt水稻)为防治二化螟提供了一种新的有效方法,Bt水稻在几年后将在中国实现商业化种植。在Bt水稻未商业化种植之前检测二化螟田间种群对Cry1Ab的抗性等位基因频率,可以为制定预防性抗性治理策略、实施二化螟Bt早期抗性的监测和预警提供重要依据。本研究采用F2筛选法(F2 screen)检测了浙江温州地区二化螟田间种群对Cry1Ab的抗性等位基因频率,并对进行了室内抗性品系的筛选;同时对二化螟的一个氨肽酶N基因(CsAPN3)进行了克隆、序列分析和mRNA表达检测。1.F2筛选法检测二化螟温州种群对Cry1Ab的抗性等位基因频率2009年从浙江温州田间水稻上采集一代二化螟卵块,每一卵块单独饲养以建立单雌系。用Cry1Ab区分剂量对201个单雌系F2代进行了检测,发现田间种群存在对Cry1Ab的主要抗性等位基因,抗性等位基因频率估计为0.0025(95%置信区间:0.0019-0.0031)。2.二化螟对Cry1Ab抗性的室内筛选将F2检测中7个候选单雌系在区分剂量下的存活幼虫建立一个混合种群,并用Cry1Ab对其进行室内抗性筛选。连续筛选6代后,该种群对Cry1Ab的敏感性明显下降,在区分剂量下的存活率由筛选前的5%提高到35%。与苍南敏感品系相比,该筛选种群对Cry1Ab已具有10倍的抗性。3.二化螟氨肽酶N基因CsAPN3的克隆、序列分析及mRNA表达利用RT_PCR和RACE技术,获得二化螟一个氨肽酶N基因的全长cDNA。根据该基因编码的氨基酸序列与其他昆虫APN的相似性,命名为CsAPN3。CsAPN3全长cDNA含有3363 bp,其开放式阅读框编码1013个氨基酸。该基因具有氨肽酶所特有的保守区域GAMEN和锌结合结构域HEXXHX18E。在CsAPN3的N-末端含有20个疏水信号序列,但C-末端没有一个具有亲脂性和跨膜特性的糖基化磷脂酰肌醇锚定点。通过实时定量PCR检测发现,二化螟CsAPN3 mRNA主要在幼虫阶段表达,幼虫中肠中CsAPN3 mRNA表达量明显高于其他组织。
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全文目录
摘要 7-9ABSTRACT 9-11第一章 文献综述 11-25 1 二化螟的发生与危害 11-12 2 转基因抗虫水稻 12-14 2.1 转Bt基因水稻 12-13 2.2 转植物或动物来源抗虫基因水稻 13-14 3 苏云金芽孢杆菌 14-19 3.1 苏云金芽孢杆菌概述 14-15 3.2 Bt毒素的杀虫机理 15-16 3.3 害虫对Bt的抗性机理 16-19 4 害虫对Bt蛋白的抗性检测方法 19-22 5 害虫对Bt作物抗性治理策略 22-23 5.1 高剂量/庇护区 23 5.2 多基因抗虫作物 23 6. 本研究的内容和意义 23-25第二章 二化螟温州田间种群对Bt毒素Cry1Ab抗性等位基因频率的F_2检测 25-39 1 材料与方法 26-27 1.1 实验材料 26-27 1.2 生物测定方法(毒素涂表法) 27 2 单雌系F_2代法检测田间抗性等位基因频率 27-30 2.1 单雌系F_2代筛选法原理 27-28 2.2 区分剂量的确定 28 2.3 单雌系的建立 28 2.4 F_1代饲养 28-29 2.5 F_2代饲养 29 2.6 F_2筛选 29 2.7 抗性等位基因验证 29 2.8 抗性等位基因频率值的计算方法 29-30 3 抗性品系的筛选 30 3.1 实验材料 30 3.2 生物测定方法(毒素涂表法) (同1.2) 30 3.3 二化螟对Cry1Ab毒素敏感毒力基线的建立 30 3.4 抗性品系的筛选 30 3.5 数据分析 30 4 结果和分析 30-35 4.1 区分剂量的确定 30-31 4.2 F_2筛选 31-32 4.3 抗性验证 32-33 4.4 抗性品系的筛选 33-34 4.5 抗性等位基因频率 34-35 5 讨论 35-39第三章 二化螟Bt毒素受体蛋白APN基因全长克隆、序列分析及mRNA表达量研究 39-57 1 材料和方法 40-41 1.1 材料和试剂 40 1.2 主要试剂 40-41 1.3 仪器设备 41 2 二化螟APN基因的克隆 41-44 2.1 总RNA的提取 41 2.2 反转录 41-42 2.3 基因克隆引物设计 42-43 2.4 PCR产物的回收与纯化 43 2.5 PCR纯化产物与质粒载体的连接 43 2.6 转化和培养 43 2.7 质粒DNA的提取(购于爱思进生物技术有限公司) 43-44 2.8 酶切反应 44 2.9 目标片段检测(PCR鉴定) 44 2.10 序列分析与系统发育树的构建 44 3 二化螟氨肽酶N基因mRNA表达量的研究 44-46 3.1 RNA的提取和cDNA第一链的合成 44 3.2 引物设计 44-45 3.3 反应体系和条件 45 3.4 实时荧光定量PCR反应效率的确定 45 3.5 数据分析 45-46 4 结果和分析 46-55 4.1 二化螟氨肽酶N序列分析 46-52 4.2 二化螟氨肽酶N基因相对表达量研究 52-55 5 讨论 55-57全文总结 57-59参考文献 59-71致谢 71
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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 虫害 > 水稻螟虫
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