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二化螟温州种群Cry1Ab抗性基因频率的F2检测及氨肽酶N基因CsAPN3的克隆

作　者: 侯雪水
导　师: 吴益东
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 二化螟 F2筛选 抗性等位基因频率 氨肽酶N Cry1Ab
分类号: S435.112.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


二化螟Chilo suppressalis(Walker)是我国水稻上一种重要害虫,目前主要依靠化学杀虫剂进行控制。转Bt基因抗虫水稻(Bt水稻)为防治二化螟提供了一种新的有效方法,Bt水稻在几年后将在中国实现商业化种植。在Bt水稻未商业化种植之前检测二化螟田间种群对Cry1Ab的抗性等位基因频率,可以为制定预防性抗性治理策略、实施二化螟Bt早期抗性的监测和预警提供重要依据。本研究采用F2筛选法(F2 screen)检测了浙江温州地区二化螟田间种群对Cry1Ab的抗性等位基因频率,并对进行了室内抗性品系的筛选；同时对二化螟的一个氨肽酶N基因(CsAPN3)进行了克隆、序列分析和mRNA表达检测。1.F2筛选法检测二化螟温州种群对Cry1Ab的抗性等位基因频率2009年从浙江温州田间水稻上采集一代二化螟卵块,每一卵块单独饲养以建立单雌系。用Cry1Ab区分剂量对201个单雌系F2代进行了检测,发现田间种群存在对Cry1Ab的主要抗性等位基因,抗性等位基因频率估计为0.0025(95%置信区间：0.0019-0.0031)。2.二化螟对Cry1Ab抗性的室内筛选将F2检测中7个候选单雌系在区分剂量下的存活幼虫建立一个混合种群,并用Cry1Ab对其进行室内抗性筛选。连续筛选6代后,该种群对Cry1Ab的敏感性明显下降,在区分剂量下的存活率由筛选前的5%提高到35%。与苍南敏感品系相比,该筛选种群对Cry1Ab已具有10倍的抗性。3.二化螟氨肽酶N基因CsAPN3的克隆、序列分析及mRNA表达利用RT_PCR和RACE技术,获得二化螟一个氨肽酶N基因的全长cDNA。根据该基因编码的氨基酸序列与其他昆虫APN的相似性,命名为CsAPN3。CsAPN3全长cDNA含有3363 bp,其开放式阅读框编码1013个氨基酸。该基因具有氨肽酶所特有的保守区域GAMEN和锌结合结构域HEXXHX18E。在CsAPN3的N-末端含有20个疏水信号序列,但C-末端没有一个具有亲脂性和跨膜特性的糖基化磷脂酰肌醇锚定点。通过实时定量PCR检测发现,二化螟CsAPN3 mRNA主要在幼虫阶段表达,幼虫中肠中CsAPN3 mRNA表达量明显高于其他组织。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11第一章 文献综述  11-25  1 二化螟的发生与危害  11-12  2 转基因抗虫水稻  12-14    2.1 转Bt基因水稻  12-13    2.2 转植物或动物来源抗虫基因水稻  13-14  3 苏云金芽孢杆菌  14-19    3.1 苏云金芽孢杆菌概述  14-15    3.2 Bt毒素的杀虫机理  15-16    3.3 害虫对Bt的抗性机理  16-19  4 害虫对Bt蛋白的抗性检测方法  19-22  5 害虫对Bt作物抗性治理策略  22-23    5.1 高剂量/庇护区  23    5.2 多基因抗虫作物  23  6. 本研究的内容和意义  23-25第二章 二化螟温州田间种群对Bt毒素Cry1Ab抗性等位基因频率的F_2检测  25-39  1 材料与方法  26-27    1.1 实验材料  26-27    1.2 生物测定方法(毒素涂表法)  27  2 单雌系F_2代法检测田间抗性等位基因频率  27-30    2.1 单雌系F_2代筛选法原理  27-28    2.2 区分剂量的确定  28    2.3 单雌系的建立  28    2.4 F_1代饲养  28-29    2.5 F_2代饲养  29    2.6 F_2筛选  29    2.7 抗性等位基因验证  29    2.8 抗性等位基因频率值的计算方法  29-30  3 抗性品系的筛选  30    3.1 实验材料  30    3.2 生物测定方法(毒素涂表法) (同1.2)  30    3.3 二化螟对Cry1Ab毒素敏感毒力基线的建立  30    3.4 抗性品系的筛选  30    3.5 数据分析  30  4 结果和分析  30-35    4.1 区分剂量的确定  30-31    4.2 F_2筛选  31-32    4.3 抗性验证  32-33    4.4 抗性品系的筛选  33-34    4.5 抗性等位基因频率  34-35  5 讨论  35-39第三章 二化螟Bt毒素受体蛋白APN基因全长克隆、序列分析及mRNA表达量研究  39-57  1 材料和方法  40-41    1.1 材料和试剂  40    1.2 主要试剂  40-41    1.3 仪器设备  41  2 二化螟APN基因的克隆  41-44    2.1 总RNA的提取  41    2.2 反转录  41-42    2.3 基因克隆引物设计  42-43    2.4 PCR产物的回收与纯化  43    2.5 PCR纯化产物与质粒载体的连接  43    2.6 转化和培养  43    2.7 质粒DNA的提取(购于爱思进生物技术有限公司)  43-44    2.8 酶切反应  44    2.9 目标片段检测(PCR鉴定)  44    2.10 序列分析与系统发育树的构建  44  3 二化螟氨肽酶N基因mRNA表达量的研究  44-46    3.1 RNA的提取和cDNA第一链的合成  44    3.2 引物设计  44-45    3.3 反应体系和条件  45    3.4 实时荧光定量PCR反应效率的确定  45    3.5 数据分析  45-46  4 结果和分析  46-55    4.1 二化螟氨肽酶N序列分析  46-52    4.2 二化螟氨肽酶N基因相对表达量研究  52-55  5 讨论  55-57全文总结  57-59参考文献  59-71致谢  71

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 虫害 > 水稻螟虫
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