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梅AGAMOUS（AG）基因的克隆与表达分析

作　者: 侯计华
导　师: 高志红
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 果梅 MADS-box AGAMOUS 克隆表达
分类号: S662.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 38次
引　用: 2次
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内容摘要

梅(Prunus mume Sieb. et Zucc.)原产中国,属于蔷薇科李属植物。在我国栽培历史悠久,品种资源丰富。梅果营养丰富,花形态多样但是果梅中存在着雌蕊败育的现象。影响雌蕊发育的因素很多,外界因素如温度、水分、机械损伤等,内部因素包括植物激素水平、营养水平等,这些因素影响了花发育基因的表达和花器官的形成,但目前还未见分子水平的报道。AG基因控制第3、4轮花器官雄蕊及心皮的发育,这对果树的产量和发育是极为重要的,因为心皮是果实发育的前体。为探索梅花器官发育的分子机理,本研究利用MADS box基因的保守性特征从其花中分离和克隆了一个MADS box蛋白基因AG并对该基因的表达进行了初步分析。1.采用RT-PCR及3’RACE的方法克隆果梅AG基因的全长并测序,登录号为EU068730。AG基因cDNA全长为812bp,包含由243个氨基酸编码的长为732bp的开放阅读框(ORF)。进行基因序列及特征分析。序列进化分析表明,该基因同桃的AG类基因高度同源,同源率高达9%。2.利用RT-PCR技术以及荧光定量PCR技术分析结果显示,AG基因主要在果梅的萼片、雄蕊、雌蕊、果皮和种子均能检测到,且表达量较高,但是在叶片以及花器官的花瓣中不表达。进一步采用原位杂交分析AG基因的表达情况,初步分析认为AG基因的转录表达主要在果梅的生殖器官如萼片、雄蕊、成熟的花药及花粉粒上都具有组织上的特异性表达,而在花瓣上没有表达。3.构建了AG植物双元表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草,共获得15株Hyg阳性苗。PCR检测发现11个潮霉素阳性株系均检测到目的条带,初步说明AG基因已整合到烟草基因组中；对其中11个PCR阳性株系进行RT-PCR分析,结果显示AG基因在这些转基因烟草株系中均发生了转录。比较转基因烟草与对照的植株大小,发现转基因的烟草植株与对照相比,雄蕊中的花药低于雌蕊或与雌蕊齐平,而且花瓣颜色变成了浅粉色。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
缩略词(Abbreviation)  10-11
前言  11-12
第一章文献综述  12-22
  1 花器官的发育  12-17
    1.1 花发育的ABC模型及其发展  12-15
      1.1.1 经典ABC模型  12-13
      1.1.2 花发育的ABCD模型  13-14
      1.1.3 花发育的ABCDE模型  14
      1.1.4 花发育的四重奏模型  14-15
    1.2 MADS-box基因研究进展  15-16
    1.3 MADS-box基因研究前景  16-17
  2 AGAMOUS及其同源基因的功能  17-19
  3 植物基因表达方法  19-22
    3.1 Northern印迹法  19
    3.2 RT-PCR法  19
    3.3 实时定量RT-PCR  19-20
    3.4 原位杂交技术  20-22
第二章果梅AG基因的克隆与序列分析  22-30
  摘要  22
  1 材料和方法  22-25
    1.1 试验材料与试剂  22-23
    1.2 方法  23-25
      1.2.1 总RNA的提取  23
      1.2.2 cDNA第一链的合成  23
      1.2.3 RT-PCR  23
      1.2.4 PCR产物的回收  23
      1.2.5 目的片段T载体的连接,转化及鉴定  23-24
      1.2.6 大肠杆菌质粒提取  24
      1.2.7 序列及系统发育分析  24-25
  2 结果与分析  25-30
    2.1 总RNA提取  25
    2.2 RT-PCR扩增果梅AG基因序列  25-26
    2.3 AG基因序列分析  26-28
      2.3.1 同源性分析  26-27
      2.3.2 系统发育分析  27-28
    3 讨论  28-30
第三章利用RT-PCR和荧光定量PCR研究AG基因的表达模式  30-38
  摘要  30
  1 材料和方法  30-32
    1.1 试验材料  30
    1.2 各器官RNA的提取  30
    1.3 cDNA第一链的合成  30
    1.4 果梅AG基因的RT-PCR扩增  30-31
    1.5 定量PCR(qRT-PCR)  31-32
      1.5.1 RNA提取和cDNA合成  31
      1.5.2 蛋白延伸因子EF-1a和AG基因片段的克隆  31
      1.5.3 定量PCR  31-32
  2 结果分析  32-36
    2.1 AG基因在不同果梅组织中的RT-PCR表达分析  32-33
    2.2 荧光定量PCR  33-36
      2.2.1 RT-PCR引物的特异性扩增检测  33-34
      2.2.2 荧光定量PCR时空表达  34-35
      2.2.3 荧光定量后琼脂糖凝胶电泳检测  35-36
  3 讨论  36-38
第四章原位杂交技术研究果梅AG基因表达  38-44
  摘要  38
  1 材料  38
    1.1 植物材料  38
    1.2 载体  38
    1.3 主要试剂  38
  2 原位杂交方法  38-41
    2.1 正义、反义探针制备  39
    2.2 探针半定量  39
    2.3 果梅花芽的固定与石蜡包埋  39-40
    2.4 杂交和显色  40-41
  3 结果及分析  41-44
    3.1 探针半定量  41-42
    3.2 结果分析与讨论  42-44
第五章农杆菌介导果梅AG基因转化烟草  44-54
  摘要  44
  1 材料和方法  44-48
    1.1 材料  44-45
      1.1.1 植物材料  44-45
      1.1.2 试剂  45
      1.1.3 烟草组织培养培养基  45
    1.2 试验方法  45-48
      1.2.1 AG基因双元表达载体的构建及鉴定  45
      1.2.2 农杆菌菌株的活化  45
      1.2.3 烟草叶盘法遗传转化  45-46
      1.2.4 转AG基因烟草的分子检测  46-48
  2 结果与分析  48-51
    2.1 AG基因双元表达载体的构建及鉴定  48-49
    2.2 转AG基因烟草的PCR检测  49-50
    2.3 转AG基因烟草的RT-PCR检测  50
    2.4 转AG基因烟草表型观察  50-51
  3 讨论  51-54
全文结论  54-56
参考文献  56-62
附录本文中常用试剂及培养基的配置  62-66
致谢  66

梅AGAMOUS（AG）基因的克隆与表达分析

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