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人肥胖基因在毕赤酵母中的表达

作　者: 聂芬
导　师: 龙良启
学　校: 华中农业大学
专　业: 水生生物学
关键词: 肥胖基因瘦素毕赤酵母克隆表达
分类号: Q786
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 31次
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内容摘要

肥胖基因编码的蛋白质(leptin)是反映体内脂肪含量和调节体重的重要信号因子，leptin能显著降低脂肪组织数量、促进青春期发育，对机体的免疫应答、繁殖功能、神经内分泌等功能具有重要的作用。本文根据已报道的人肥胖基因cDNA序列设计引物，PCR扩增出人肥胖基因的cDNA编码序列，然后将此定向克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的α因子信号肽编码序列3′端，构建成重组酵母表达载体，测序分析表明该cDNA序列由438个核苷酸组成，编码146个氨基酸组成的多肽。用化学方法转化毕赤酵母GS115，经PCR鉴定证实，目的基因整合到重组酵母菌染色体中，对重组酵母进行G418筛选和4天的诱导表达，然后对阳性克隆进行了为期4天的诱导表达，SDS-PAGE未检测到目的产物的表达。根据巴斯德毕赤酵母表达系统的密码子偏爱性，对肥胖基因进行了简并改造和人工合成，然后将改造过的人肥胖基因以正确的读码框架插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K的α因子信号肽编码序列3′端，构建成重组酵母表达载体，测序结果与预期一致。重组酵母用同样方法进行了为期4天的诱导表达，并通过SDS-PAGE和放免检测，得到一株表达目的蛋白量最高的重组酵母菌，该重组蛋白表达水平可达7.71mg／L，不同浓度G418筛选表明该酵母菌是高拷贝的。SDS-PAGE检测表明分泌蛋白分子量约为16kD。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-8
缩略词表  8-9
1 前言  9-15
  1.1 人肥胖基因的发现  9
  1.2 人ob基因和leptin的基本结构  9-10
    1.2.1 ob基因的基本结构  9
    1.2.2 leptin的基本结构  9-10
  1.3 人leptin受体(ob-R)  10-11
  1.4 人leptin的功能  11-13
    1.4.1 leptin与体重  11
    1.4.2 leptin与生殖发育  11
    1.4.3 leptin与免疫功能  11-12
    1.4.4 leptin与妊娠和胎儿的发育  12
    1.4.5 leptin与造血功能  12
    1.4.6 leptin对骨代谢的作用  12-13
    1.4.7 leptin对组织代谢的作用  13
  1.5 人ob基因的体外表达研究  13
  1.6 毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统  13-15
    1.6.1 毕赤酵母表达系统  13-14
    1.6.2 毕赤酵母表达系统的应用  14-15
2 本研究的目的与意义  15-16
3 材料与方法  16-26
  3.1 材料  16-19
    3.1.1 质粒与菌株  16
    3.1.2 主要试剂  16
    3.1.3 主要溶液的配制  16-19
  3.2 方法  19-26
    3.2.1 人ob片段的PCR扩增  19-20
    3.2.2 人ob片段PCR扩增产物的回收  20
    3.2.3 人ob片段和酵母表达载体pPIC9K的双酶切  20
    3.2.4 酵母表达载体的构建  20-21
    3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)  21
    3.2.6 连接产物的转化  21-22
    3.2.7 重组质粒的快速鉴定  22
    3.2.8 质粒的提取(碱裂解法)  22
    3.2.9 重组质粒的酶切鉴定  22
    3.2.10 人ob基因的序列测定  22
    3.2.11 重组表达载体的线型化  22-23
    3.2.12 酵母菌感受态细胞的制备  23
    3.2.13 酵母菌的转化  23
    3.2.14 酵母基因组 PCR模板制备  23-24
    3.2.15 酵母阳性重组子 PCR筛选  24
    3.2.16 阳性转化子 Mut表型鉴定  24
    3.2.17 重组酵母的小量诱导表达  24-25
    3.2.18 多拷贝酵母重组子的筛选  25
    3.2.19 表达产物的SDS-PAGE电泳检测  25
    3.2.20 人ob基因的改造及其在毕赤酵母中的表达  25
    3.2.21 放免检测分析  25-26
4 结果与分析  26-32
  4.1 人ob基因cDNA的获得  26
  4.2 重组质粒酶切鉴定  26-27
  4.3 重组质粒的 PCR鉴定  27
  4.4 人ob基因序列测定结果  27-28
  4.5 重组酵母的鉴定与表达(基因未改造)  28-29
  4.6 人ob基因的密码子改造结果  29-30
  4.7 基因改造后重组酵母的鉴定  30
  4.8 Mut表型鉴定  30
  4.9 诱导产物的放免分析及阳性重组子G418抗性分析  30-31
  4.10 诱导产物的SDS-PAGE电泳检测  31-32
5 讨论  32-35
  5.1 酵母表达重组质粒的构建  32
  5.2 阳性克隆 PCR模板制备  32
  5.3 酵母表达重组质粒转化与筛选  32-33
  5.4 酵母的诱导表达  33-35
6 小结  35-36
参考文献  36-42
致谢  42

人肥胖基因在毕赤酵母中的表达

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