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应用水痘—带状疱疹病毒报告细胞系定量带细胞病毒的研究

作　者: 卢珍玲
导　师: 程波；王官清
学　校: 福建医科大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 水痘-带状疱疹病毒报告细胞系抗病毒定量
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

【目的】构建水痘-带状疱疹病毒(VZV)ORF62表达质粒,并应用VZV报告细胞系MV9G定量带细胞病毒(CAV),以建立筛选抗VZV药物并研究其作用机制的新方法。【方法】1、以VZV疫苗株BKvOka基因组DNA为模板、PCR扩增获得ORF62全序列后克隆到高效表达质粒pCAGGS中构建BKvOka ORF62表达质粒pCAG-BKvOka62,再应用双酶切和DNA测序法鉴定所构建质粒的正确性。2、将倍比稀释的BKvOka株感染MeWo细胞(含BKvOka株CAV)与MV9G细胞共培养72h后,分别用化学发光法检测BKvOka株CAV激发MV9G细胞表达的萤火虫荧光素酶(RLU)、用间接免疫酶法染色并计数病毒蚀斑(focus numbers)、用SYBR Green荧光定量PCR法检测病毒DNA拷贝数(DNA copies),分别计算RLU/病毒蚀斑数和RLU/病毒DNA拷贝数的比值,分析其相关性,并建立RLU-病毒蚀斑数、RLU-病毒DNA拷贝数和病毒DNA拷贝数-病毒蚀斑数的标准曲线。在培养基中加入阿昔洛韦(ACV)以抑制病毒生长,再以相同方法建立ACV作用下RLU-病毒蚀斑数、RLU-病毒DNA拷贝数和病毒DNA拷贝数-病毒蚀斑数的标准曲线。3、将随机稀释的GSKvOka株感染MeWo细胞(含GSKvOka株CAV)与MV9G细胞共培养72h后,仍用上述方法检测GSKvOka株CAV激发MV9G细胞表达的萤火虫荧光素酶(RLU)、病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数。再以MV9G细胞荧光素酶RLU为基数,根据绘制标准曲线时所得RLU/病毒蚀斑数和RLU/病毒DNA拷贝数比值推算GSKvOka株蚀斑数和DNA拷贝数,获得病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数预测值,并将预测值与其实测值比较,以验证应用MV9G细胞定量CAV的可行性。【结果】1、通过将BKvOka株ORF62全序列克隆到pCAGGS表达质粒构建了VZV ORF62重组表达质粒pCAG-BKvOka62。经双酶切反应和DNA测序鉴定,克隆的ORF62片段与预期一致,VZV ORF62表达质粒pCAG-BKvOka62得以成功构建。2、将倍比稀释的BKvOka株CAV与MV9G细胞共培养72h后,BKvOka株CAV激发MV9G细胞表达的荧光素酶(RLU)与病毒蚀斑数显著相关(r = 0.999, P < 0.01)、与病毒DNA拷贝数显著相关(r = 0.974, P < 0.01),病毒DNA拷贝数与病毒蚀斑数显著相关(r = 0.979, P < 0.01),RLU/病毒蚀斑数=181.62,RLU/病毒DNA拷贝数=1.97×10-4。加入抗病毒药物ACV后RLU与病毒蚀斑数显著相关(r = 0.991, P < 0.01)、与病毒DNA拷贝数显著相关(r =0.971, P < 0.01),病毒DNA拷贝数与病毒蚀斑数显著相关(r = 0.936, P < 0.05)。3、将随机稀释的GSKvOka株CAV与MV9G细胞共培养72h后,GSKvOka株CAV激发MV9G细胞表达的荧光素酶(RLU)与病毒蚀斑数显著相关(r = 0.992, P < 0.01)、与病毒DNA拷贝数显著相关(r = 0.988, P < 0.01),病毒DNA拷贝数与病毒蚀斑数显著相关(r = 0.966, P < 0.01)。根据GSKvOka株CAV激发MV9G细胞荧光素酶RLU值推算的病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数预测值与其实测值基本一致。【结论】1、成功构建BKvOka株ORF62表达质粒pCAG-BKvOka62,为荧光定量PCR法检测VZV DNA提供了质粒模板标准品,为进一步应用VZV报告细胞系定量CAV奠定了基础。2、以已知量BKvOka株CAV与MV9G细胞共培养时,无论是否加入抗病毒药物ACV,BKvOka株CAV激发MV9G细胞表达的萤火虫荧光素酶(RLU)与病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数均显著相关。以未知量GSKvOka株CAV与MV9G细胞共培养时CAV激发MV9G细胞表达的荧光素酶(RLU)与病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数仍显著相关。根据RLU推算出的病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数的预测值与其实测值基本一致。提示MV9G细胞与CAV共培养时受CAV激发表达荧光素酶RLU的变化可以反映病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数的变化。因此,应用MV9G细胞定量CAV是可行的。3、应用VZV报告细胞MV9G定量CAV克服了免疫酶染色法和荧光定量PCR法过程烦琐、难客观、易污染等缺点,具有简便、快速、敏感、客观和高通量的特点,为进一步建立抗VZV药物筛选和作用机制研究方法奠定了基础。

全文目录

英文缩略词表  4-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-10
引言  10-13
第一部分水痘-带状疱疹病毒ORF62 表达质粒的构建  13-27
  1. 实验材料  13-14
  2. 实验方法  14-23
  3. 实验结果  23-26
  4. 讨论  26
  5. 结论  26-27
第二部分应用水痘-带状疱疹病毒报告细胞系定量带细胞病毒的研究  27-39
  1. 实验材料  27-28
  2. 实验方法  28-30
  3. 实验结果  30-36
  4. 讨论  36-38
  5. 结论  38-39
参考文献  39-41
已发表文章  41-42
致谢  42-43
文献综述  43-49

应用水痘—带状疱疹病毒报告细胞系定量带细胞病毒的研究

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