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主栽抗病品种对RSV的抗性特征和抗病转基因水稻材料的创制

作 者: 陈洁
导 师: 周益军
学 校: 南京农业大学
专 业: 植物病理学
关键词: 水稻条纹叶枯病 抗性评价 转基因水稻 2-5A系统基因 抗病毒
分类号: S511
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要


由水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)引起的水稻条纹叶枯病是目前水稻生产上最重要的病毒病害,由介体灰飞虱(Aodelphax striatellus Fallen, SBPH)传播。曾分布于我国16个省市,近年来在华东稻区严重发生,其中以粳稻主产区的江苏省发生最为严重,自2004年江苏省水稻条纹叶枯病特大爆发以来,全省共有42个县发生此种病害,波及面积达2320万亩,给水稻生产造成了巨大的损失。抗病品种的应用是防治病害最经济有效的措施。本研究重点进行主栽抗病品种抗性特征的分析以及抗病毒转基因材料的创制,主要研究内容包括两大方面。一是选取江苏地区8个主栽抗病粳稻品种,采用苗期接种鉴定、非嗜性测验和抗生性测验的方法分析品种的抗病性和抗虫性,二是通过转基因技术,将非病毒来源的2-5A系统基因导入受体水稻盐粳1中,获得转2-5A系统基因的水稻材料并对其进行抗病毒分析。主要结果如下:1、8个主栽抗病粳稻品种徐稻3号、徐稻4号、盐稻8号、镇稻88、宁粳3号、镇稻99、连粳4号和镇稻8号的抗病性和抗虫性表现并不一致。抗病性分析发现,供试品种均抗RSV;抗虫性分析发现,镇稻88和镇稻99表现为较弱的抗虫性,其余品种均表现为无抗虫性。这表明供试抗病品种对水稻条纹叶枯病表现的抗性主要来源于对病毒的抗性。2、将2-5A合成酶基因和RNase L分别克隆到载体pAMM2106和pAMM2109上,农杆菌法转化水稻愈伤组织,获得转2-5A系统基因水稻。设计两基因的特异性引物对转基因植株逐代进行PCR筛选,在T3代获得1个编号为4的材料,PCR检测其T4代8个株系4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7和4-8均表现为双阳性。采用Southern blot和RT-PCR进一步分析,Southern分析表明目的基因RNase L已经整合进T4代水稻基因组中,RT-PCR分析表明转入基因在T4代转基因水稻中能正常转录,故认为目的基因已经整合进T4代水稻基因组中,外源基因已经稳定遗传到T4代。同时对T4代转基因株系进行室内抗病毒分析,分别接种RSV和水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV),抗性分析表明较受体水稻品种盐粳21,8个株系对RSV的抗性提高15.31%~34.66%,4个株系对RBSDV的抗性提高9.4%~23.53%。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11引言  11-12上篇 文献综述  12-29  1 水稻条纹叶枯病病理学研究现状  13-17    1.1 RSV分类地位、基本特性  13-15      1.1.1 RSV的分子生物学特性  13-14      1.1.2 RSV的分子变异及致病性分化  14-15    1.2 水稻条纹叶枯病传毒介体的基本特性  15-17      1.2.1 灰飞虱的生物学特性  15-16      1.2.2 灰飞虱的传毒机制  16-17  2 水稻条纹叶枯病的分布和危害  17-20    2.1 病害症状  17    2.2 水稻条纹叶枯病的发生与分布  17-18    2.3 水稻条纹叶枯病的危害和损失  18-20  3 抗水稻条纹叶枯病研究进展  20-24    3.1 水稻抗条纹叶枯病基因资源的筛选  20-21    3.2 水稻品种抗病性和抗虫性之间的关系  21-22    3.3 遗传分析  22    3.4 基因定位  22-24  4 水稻条纹叶枯病控制策略现状  24-29    4.1 传毒介体灰飞虱的控制  25    4.2 抗水稻条纹叶枯病转基因研究现状  25-28      4.2.1 利用来源于病毒的基因策略  25-27        4.2.1.1 RSV外壳蛋白基因的研究  25-26        4.2.1.2 病毒核酶基因的研究  26-27      4.2.2 利用非病毒来源的基因策略  27-28    4.3 病毒抑制剂的利用  28    4.4 展望  28-29下篇 研究内容  29-61  第一章 主栽水稻品种对水稻条纹叶枯病的抗性特征  31-43    1 材料与方法  32-36      1.1 材料与仪器  32      1.2 传毒介体的筛选  32-33      1.3 水稻条纹叶枯病抗性鉴定  33-35        1.3.1 DIBA检测单头灰飞虱  33-34        1.3.2 苗期接种鉴定  34        1.3.3 鉴定标准  34-35      1.4 灰飞虱抗性鉴定  35-36        1.4.1 非嗜性测验  35        1.4.2 抗生性测验  35-36      1.5 统计分析  36    2 结果与分析  36-39      2.1 水稻品种对条纹病毒的抗性  36-37      2.2 水稻品种对传毒介体灰飞虱的抗性  37-39    3 讨论  39-43  第二章 转2-5A系统基因水稻材料的创制及其抗病毒分析  43-61    1 材料  44-45      1.1 水稻品种  44      1.2 载体和菌种  44      1.3 试剂与仪器  44-45    2 方法  45-52      2.1 水稻愈伤组织的诱导及培养  45      2.2 根癌农杆菌的培养及其介导的水稻转化  45-46        2.2.1 根癌农杆菌的培养  45-46        2.2.2 水稻受体材料的侵染及其根癌农杆菌的共培养  46        2.2.3 抗性愈伤组织的筛选及植株再生  46      2.3 转基因水稻基因组DNA的提取  46-47      2.4 PCR检测  47      2.5 southern检测  47-49      2.6 水稻总RNA的提取(Trizol法)  49-50      2.7 RT-PCR  50      2.8 PCR产物的克隆与测序  50-51        2.8.1 PCR产物的割胶纯化  50-51        2.8.2 利用T-A连接构建克隆载体  51        2.8.3 转化和筛选、测序  51      2.9 转基因株系抗病毒鉴定  51-52        2.9.1 接种体的准备  51-52        2.9.2 DIBA检测单头灰飞虱  52        2.9.3 室内接种鉴定  52    3 结果与分析  52-57      3.1 转基因水稻植株的PCR检测  52-53      3.2 转基因水稻植株的Southern blot检测  53-54      3.3 RT-PCR  54      3.4 室内抗病毒鉴定  54-57        3.4.1 转基因水稻抗RSV鉴定  54-55        3.4.2 转基因水稻抗RBSDV鉴定  55-57    4 讨论  57-61全文总结  61-63参考文献  63-71附录A 常用缓冲液及试剂配方  71-74附录B 常用生化及分子生物学试剂与仪器  74-75攻读硕士学位期间发表论文  75-77致谢  77

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