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亚洲棉GaP5CS和GaTPS基因启动子的克隆与功能分析

作　者: 曾小林
导　师: 李付广
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 吡咯琳-5-羧酸合成酶海藻糖-6-磷酸合成酶启动子转基因植株缺失分析
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 99次
引　用: 2次
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内容摘要

在转基因植物工程中,多数采用的是花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子等组成型启动子,它们驱动外源基因在植物的各种组织和各发育时期都表达,因而往往造成物质和能量的浪费,增加了植物的代谢负担,甚至引起植物形态发生改变,影响植物生长发育。因此,采用组织特异启动子或诱导型启动子启动外源基因在转基因植物中特定组织中得到表达,不但可以降低植物耗能、减轻对植物形态和生长发育的影响,还可以提高外源基因在特定部位的表达浓度,增加转基因的效果。脯氨酸和海藻糖是两种重要的渗透调节物质,吡咯琳-5-羧酸合成酶(pyrroline-5-carboxyate synthetase,P5CS)与海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)分别是脯氨酸和合成途径中的关键酶。本研究从亚洲棉中克隆出P5CS基因启动子和TPS基因启动子,分别命名为GaPROP5CS和GaPROTPS。取得的研究结果如下:1启动子的克隆和序列分析利用改良的TAIL-PCR法,从亚洲棉基因组中扩增出2个基因的5’端上游序列,命名为GaPROP5CS和GaPROTPS。GaPROP5CS全长795bp,找到转录起始位点A,TATAbox位于-22处; GaPROTPS全长1269bp,TATAbox距离转录起始位点A有32bp。2启动子的瞬时表达分析构建了GaP5CS和GaTPS的启动子和GUS融合基因表达载体,利用基因枪转化法将两种载体转入洋葱表皮细胞,并以含有PEG的培养基进行后期培养。通过GUS染色结果推测2个启动子是受旱胁迫诱导启动子。3启动子的功能分析通过农杆菌介导法分别将GaPROP5CS和GaPROTPS转入烟草进行功能验证。在干旱胁迫处理条件下,在转基因植株的叶片和根部都发现GUS基因的表达,从GUS酶活性测定结果表明启动子都具有较强的表达活性,在干旱胁迫诱导后表达活性得到提高。为了进一步研究GaPROP5CS S启动子在棉花中的启动活性,接着将GaPROP5CS启动子通过农杆菌介导法转化陆地棉,继续探讨启动子在转基因棉中的启动活性。4启动子缺失片段的获得和功能分析初步探索GaPROP5CS启动子序列中负调控元件,利用PCR法构建了8段启动子5,端缺失序列,通过基因枪转化法转化洋葱表皮细胞, PEG胁迫下检测GUS的表达,GUS活性测定结果表明, -444/+52缺失启动子以及-123/+52响应旱胁迫诱导活性最强,与CaMV-35S活性相当。为了进一步研究缺失启动子片段活性的强弱,将上述表达活性强的缺失启动子构建的表达载体转化农杆菌,利用农杆菌转化法转化烟草,以探讨GaPROP5CS缺失片段中活性最强缺失启动子。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-13
英文缩略表  13-14
第一章引言  14-25
  1.1 植物启动子研究进展  14-17
    1.1.1 植物启动子的组成和功能结构  14-16
    1.1.2 启动子的分类  16-17
  1.2 启动子的应用  17-22
    1.2.1 外源启动子在棉花中的应用  17-20
    1.2.2 来自棉花中自身启动子的研究与应用  20-22
  1.3 棉花的耐旱性研究  22-23
    1.3.1 植物渗透调节物质与棉花耐旱性  22
    1.3.2 棉花耐旱育种  22-23
  1.4 实验研究的目的和意义  23
  1.5 实验技术路线  23-25
第二章亚洲棉 GaP5CS 和 GaTPS 基因的启动子克隆及序列分析  25-41
  2.1 实验材料  25-26
    2.1.1 植物材料  25
    2.1.2 菌株与载体  25
    2.1.3 酶与生化试剂  25-26
    2.1.4 引物合成  26
    2.1.5 培养基  26
  2.2 实验方法  26-33
    2.2.1 植物材料的培养  26
    2.2.2 棉花基因组DNA 的提取  26-27
    2.2.3 启动子的克隆  27-33
  2.3 结果与分析  33-39
    2.3.1 棉花基因组DNA 的提取  33-34
    2.3.2 启动子的克隆  34-36
    2.3.3 亚洲棉GaP5CS 和GaTPS 基因启动子的生物信息学分析  36-39
  2.4 讨论  39-41
    2.4.1 改良的TAIL-PCR 法扩增基因上游序列中存在的问题  39-40
    2.4.2 GaP5CS 基因启动子和 GaTPS 基因启动子的分析  40-41
第三章亚洲棉GaPROP5CS 和GaPROTPS 启动子植物表达载体的构建和瞬时表达分析  41-52
  3.1 实验材料  41-42
    3.1.1 植物材料和主要仪器  41
    3.1.2 菌株及载体  41
    3.1.3 酶与试剂  41
    3.1.4 引物合成及测序  41
    3.1.5 植物组织培养基  41-42
  3.2 实验方法  42-48
    3.2.1 中间载体 pCBI(由 pBI121 与 pCAMBIA 2300 构建而成)的构建  42
    3.2.2 GaPROP5CS 和 GaPROTPS 启动子表达载体的构建  42-44
    3.2.3 对照表达载体 pCBI-CaMV 35S 与 pCBI-rd29A 的构建  44-45
    3.2.4 启动子的瞬时表达分析  45-48
  3.3 结果与分析  48-50
    3.3.1 启动子表达载体的构建  48
    3.3.2 pCBI-CaMV 35S 与 pCBI-rd29A 载体的构建  48-49
    3.3.3 启动子瞬时表达分析  49-50
  3.4 讨论  50-52
第四章表达载体的农杆菌的转化及植物转化  52-68
  4.1 实验材料  52
    4.1.1 植物材料  52
    4.1.2 菌株及载体  52
    4.1.3 酶与化学试剂  52
  4.2 实验方法  52-59
    4.2.1 含有植物表达载体的农杆菌转化  52-53
    4.2.2 叶盘转化法转化烟草  53-54
    4.2.3 农杆菌介导法转化棉花  54-56
    4.2.4 转基因阳性植株的筛选  56-57
    4.2.5 启动子的组织表达模式分析  57
    4.2.6 GUS 基因表达的定量分析  57-59
  4.3 实验结果  59-67
    4.3.1 农杆菌的转化  59-61
    4.3.2 转基因烟草的获得  61-62
    4.3.3 农杆菌介导法转化棉花  62-63
    4.3.4 转基因烟草阳性植株的分子检测  63-64
    4.3.5 启动子在转基因烟草中的组织表达模式分析  64-65
    4.3.6 GUS 蛋白测定和 GUS 酶活活性分析  65-67
  4.4 讨论  67-68
第五章亚洲棉 GaPROP5CS 启动子的缺失分析  68-74
  5.1 实验材料  68
    5.1.1 植物材料  68
    5.1.2 菌株、载体、酶与试剂  68
    5.1.3 引物合成及测序  68
  5.2 实验方法  68-70
    5.2.1 启动子缺失片段的获得以及表达载体的构建  68-70
    5.2.2 启动子缺失表达载体的基因枪转化  70
    5.2.3 部分高活性缺失启动子的烟草转化  70
  5.3 实验结果与分析  70-73
    5.3.1 启动子缺失片段的扩增  70-71
    5.3.2 启动子缺失载体的瞬时表达分析  71-72
    5.3.3 高活性缺失启动子的鉴定  72-73
  5.4 讨论  73-74
第六章创新点  74-75
第七章结论  75-77
  7.1 结论  75
  7.2 研究探讨  75-77
参考文献  77-83
致谢  83-84
作者简历  84

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