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小麦耐盐相关基因的作图及克隆

作　者: 马丽清
导　师: 贾继增；王国英
学　校: 中国农业大学
专　业: 遗传学
关键词: 小麦耐盐性 QTL 吡咯琳-5-羧酸合成酶吡咯琳-5-羧酸还原酶
分类号: S512.1
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

小麦是我国的第二人粮食作物,土壤的盐渍化严重制约着小麦的生产,提高小麦的抗盐性是小麦的重要育种目标之一。运用分子生物学手段,通过耐盐相关基因作图和克隆,不公为小麦耐盐分子机制提供理论依据,而且为最终实现转基因耐盐小麦奠定了基础。本研究通过QTL分析,抗盐相关基因的同源序列克隆及功能验证取得了以下结果: 1.本实验采用Opata85×W7984 RIL群体及已构建的遗传连锁图,用芽期耐盐指数,胚根鲜重、干重,胚芽鲜重、干重,苗期盐害指数,植株干重、鲜重,根冠比,叶片脯氨酸含量,叶片叶绿素含量等多个耐盐相关生理指标,采用QTLmapper1.0软件对耐盐相关性状进行了QTL定位。共定位到69个QTLs,其中芽期22个,苗期47个。在3A染色体xglk683-xcd0460间,3B染色体xfbbl68-xbcd147间,4D染色体xcko1081-xfbb226间和6D染色体xpsr106-xfbb283间是多个性状的QTL共同指向的区段,可能是主效QTL位点。其中4D染色体上xcko1081-xfbb226间是控制芽期耐盐性的QTL位点,6D染色体xpsr106-xfbb283间是控制苗期耐盐性的QTL位点,3A染色体xglk683-xcd0460间和3B染色体xfbb168-xbcd147间是同时控制曲期和芽期的QTL位点。这些QTL位点为分子标记辅助育种和耐盐QTL的图位克隆提供了帮助。 2.吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因是脯氨酸生物合成的限速酶,本研究以耐盐的小国小麦地方品种茶淀红为试材,采用同源序列克隆方法,得到了小麦TaP5CS基因,其cDNAK度为2260bp,包含2151bp的ORF,编码717个氨基酸,含有ATP、NADPH结合位点和谷氨酸激酶、谷氨酸脱氢酶保守域,脯氨酸反馈抑制作用位点。该基因在GenBank的登陆号为AY888045。在基因组DNA上获得了7400bp的片段,约含有18个内含子,19个外显子。Southern杂交的结果表明,TaP5CS基困在小麦基因组中有2个拷贝,定位在小麦的第二部分同源群上。Northern杂交和半定量RT-PCR的结果表明,小麦TaP5CS基因是受盐胁迫诱导上调表达的基因,在盐胁迫下有2个转录高峰。将该基因转入拟南芥中,Northern blotting的结果表明在正常情况下,小麦TaPSCS基因在拟南芥中能够正常表达,在盐、PEG、ABA胁迫下,TaP5CS基因的转录本进一步积累。并且在低度和中度盐胁迫下,能促进根的伸长,根的生物量增加,提高脯氨酸的含量、可溶性蛋白含量、叶绿素的含量、促进植株的生长,提高植株地上部分的生物量。而TaP5CS基因在拟南芥中的反义表达,抑制了拟南芥AtP5CS基因的活力,降低了脯氨酸的合成积累,降低根的伸长速率。反义表达的拟南芥植株开花结实率低,果荚变小,种子数少,但种子变大。反义表达短片段P5CS262的作用要大于反义表达长片段P5CS-2151。 3.以同源序列克隆的方法在cDNA利基因组DNA水平上,获得了小麦吡咯啉-5-羧酸还原酶(TaP5CR)基因,TaP5CR1基因cDNA全长1025bp,基阅组DNA为2600bp,包含7个外显子和6个内含子,编码288个氨基酸的多肽,GenBank登陆号为AY880317。Southern杂交的结果表明,该基因有2个以上的拷贝。不同六倍体小麦的等位变异分析表明该基因是很保守的。Northern blot分

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缩略词  6-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第一章文献综述  11-29
  1.研究意义  11
  2.植物耐盐机理研究进展  11-18
    2.1.盐胁迫对植物的伤害机理  11-13
    2.2.植物的耐盐机理  13-18
  3.脯氨酸及其合成代谢途径研究进展  18-23
    3.1.脯氨酸作为渗透调节物质的地位和作用  18-19
    3.2.脯氨酸的合成途径  19-22
    3.3.脯氨酸和ABA  22-23
  4.QTL定位及植物耐盐QTL研究进展植物：  23-26
    4.1.植物耐盐QTL定位的研究进展  23-25
    4.2.耐盐相关QTLs定位、克隆及展望  25-26
  5.植物新基因发掘的方法和策略  26-27
    5.1.利用图位克隆技术进行新基因发掘  26
    5.2.利用比较基因组学进行新基因发掘  26-27
    5.3.利用突变体进行新基因发掘：  27
    5.4.利用基因表达技术进行新基因发掘  27
  6.本研究的目的和意义  27-29
第二章小麦耐盐相关QTLS的定位  29-41
  1.材料与方法  29-31
    1.1.Opata85xW7984RIL群体  29
    1.2.芽期耐盐相关性状的鉴定  29-30
    1.3.苗期耐盐性的鉴定  30
    1.4 数据分析及QTL定位  30-31
  2.结果和分析  31-37
    2.1.RIL群体及亲本的表型值  31-32
    2.2.耐盐相关性状和耐盐指数的相关分析  32-33
    2.3.耐盐相关指标的QTL作图  33-37
  3.讨论  37-41
    3.1.耐盐相关指标的选择  37-38
    3.2.耐盐QTL的定位及成簇分布  38-41
第三章小麦TAP5CS(⊿~L-PYRROLINE-5-CARBOXYLATE SYNTHETASE)基因的克隆和功能验证  41-82
  1.材料  41-42
  2.方法  42-55
  3.结果与分析  55-78
    3.1.小麦吡咯啉-5-羧酸合成酶基因的克隆  55-61
    3.2.小麦TaP5CS基因在拟南芥中过量表达  61-72
    3.3.小麦TaP5CS基因在拟南芥中的反义表达  72-78
  4.讨论  78-82
第四章小麦TAP5CR(⊿~1-PYRROLINE-5-CARBOXYLATE REDUCTASE)基因的克隆和功能验证  82-102
  1.材料  82
  2.方法  82-87
  3.结果与分析  87-99
    3.1.小麦吡咯啉-5-羧酸还原酶基因的克隆与序列分析  87-91
    3.2.小麦吡咯啉-5-羧酸还原酶基因的Southern杂交分析  91
    3.3 小麦吡咯啉-5-羧酸还原酶基因的等位变异分析  91-92
    3.4.小麦吡咯啉-5-羧酸还原酶基因Nornthern blot分析  92
    3.5.小麦吡咯啉-5-羧酸还原酶基因过量表达载体的构建  92-95
    3.6.过量表达TaP5CR基因的转基因植株鉴定  95-96
    3.7.转基因植株的功能鉴定  96-99
  4.讨论  99-102
第五章结论  102-103
参考文献  103-116
致谢  116-117
个人简历  117

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