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组成型表达AtDCGS转基因大豆的获得及鉴定

作　者: 于洋
导　师: 韩天富
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: 大豆 农杆菌介导 子叶节转化 CGS 蛋氨酸 百脉根
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


大豆(Glycine max (L. ) Merr)是植物蛋白和食用油脂的重要来源。大豆蛋白质含量高,可较好满足人类和动物的需求,但其含硫氨基酸特别是蛋氨酸含量相对缺乏,影响大豆蛋白的营养品质。蛋氨酸(Methionine,Met)是多种代谢过程的中间产物,并参与转甲基作用,在生命过程中发挥着不可替代的作用,是人类必需氨基酸之一。由于高蛋氨酸大豆种质资源缺乏,依靠常规育种手段难以获得蛋氨酸含量显著提高的品种,因此,基因工程手段成为高蛋氨酸大豆育种的必由之路。本研究通过构建含有AtDCGS基因的组成型植物表达载体,采用农杆菌介导的子叶节转化方法,将氮端部分缺失的拟南芥CGS基因导入晚熟大豆品种自贡冬豆及其他几个大豆品种中,以期分别培育可在北方长日条件下进行营养生长的牧草用高蛋氨酸大豆品系和高蛋氨酸粒用大豆品系。通过草丁膦涂抹和PCR检测,筛选、鉴定出T0代转基因阳性植株19株,并对T1代进行相应的草丁膦抗性实验和分子检测,获得生长正常的转基因阳性植株24株。为优化农杆菌介导大豆子叶节转化体系,利用含有GUS报告基因的植物转化载体进行大豆转化,对不同受体品种进行了筛选,同时在菌液活化方式、子叶划伤方式、共培养温度、抑菌剂的选择、转化添加剂使用、筛选策略以及培养基选择上进行了相关的实验,结果表明,较之划伤后侵染法,浸泡划伤侵染能够有效提高外植体的侵染效率;筛选策略以S 0/8-4替代S 2/6-2作用显著,后代植株阳性率获得显著提高,T1代阳性株比率平均在30%以上。经体系优化后,大豆遗传转化效率稳定提高,为深入开展大豆转基因育种提供了良好的技术平台。在模式植物中的研究表明,CGS氮端序列对其表达具有调控作用,尤其在蛋氨酸含量升高的情况下会降低其mRNA的稳定性而下调基因表达。本实验通过分别构建含有CGS全长序列的表达载体pGFPGUSplus-FCGS和氮端缺失序列的表达载体pGFPGUSplus-DCGS,转化豆科模式植物百脉根(Lotus corniculatus L),成功获得了转FCGS和DCGS基因的阳性植株,为探讨豆科植物蛋氨酸代谢调控机制提供了研究材料。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-11
第一章 文献综述  11-24
  1.1 农杆菌介导植物遗传转化的原理  12-13
  1.2 农杆菌介导大豆遗传转化方法  13-15
    1.2.1 子叶节转化体系  13
    1.2.2 体细胞胚转化体系  13-14
    1.2.3 胚尖转化体系  14
    1.2.4 器官愈伤组织转化体系  14
    1.2.5 其他转化方法  14-15
  1.3 影响农杆菌介导遗传转化的主要因素  15-17
    1.3.1 受体大豆基因型  15
    1.3.2 菌株和载体  15
    1.3.3 筛选策略  15-16
    1.3.4 转化添加剂  16-17
  1.4 转化系统的发展  17-19
    1.4.1 筛选标记基因的去除  17-18
    1.4.2 减少载体骨架的整合  18
    1.4.3 外源基因的定点整合  18-19
  1.5 大豆蛋白质与蛋白质组分的改良  19-21
  1.6 植物蛋氨酸的合成与调控  21-24
    1.6.1 蛋氨酸的合成  21
    1.6.2 蛋氨酸合成的调控  21-23
    1.6.3 豆科植物高蛋氨酸转基因育种  23-24
第二章 农杆菌介导大豆子叶节转化体系的优化  24-36
  2.1 材料与方法  24-31
    2.1.1 大豆受体材料  24
    2.1.2 菌株与载体  24
    2.1.3 试剂及耗材  24-25
    2.1.4 培养基配方  25-27
    2.1.5 农杆菌EHA101（pTF102.1）和EHA105（pTF102.1）的获得  27-29
    2.1.6 子叶节转化  29-30
    2.1.7 GUS 瞬时染色对转化系统的检测  30-31
  2.2 结果与讨论  31-36
    2.2.1 不同受体品种的转化效果  31-34
    2.2.2 农杆菌介导大豆子叶节转化系统的优化  34-36
第三章 转AtDCGS 基因大豆的获得及鉴定  36-48
  3.1 材料与方法  36-43
    3.1.1 受体品种  36
    3.1.2 菌株与载体  36-41
    3.1.3 农杆菌介导的大豆子叶节转化  41-43
  3.2 结果与讨论  43-48
    3.2.1 子叶节划伤处理  43
    3.2.2 再生过程中外植体的筛选  43-44
    3.2.3 T_0 再生植株的检测  44-45
    3.2.4 T_1 代种子的获得  45-46
    3.2.5 T_1 代转化植株的种植与检测  46-48
第四章 CGS 基因在百脉根蛋氨酸合成中的表达调控  48-54
  4.1 材料与方法  48-51
    4.1.1 植物材料  48
    4.1.2 菌株与载体  48
    4.1.3 pGFPGUSplus-FCGS 和pGFPGUSplus-DCGS 植物表达载体的构建  48-49
    4.1.4 转基因超级根的获得及鉴定  49-51
  4.2 结果与分析  51-54
    4.2.1 pGFPGUSplus-FCGS 和pGFPGUSplus-DCGS 植物转化载体的验证  51-52
    4.2.2 转基因超级根的获得与鉴定  52-54
第五章 讨论  54-57
  5.1 子叶节转化系统的优化  54-55
    5.1.1 农杆菌菌株  54
    5.1.2 受体基因型  54
    5.1.3 筛选剂与筛选策略  54
    5.1.4 抑菌剂及其他添加剂  54-55
    5.1.5 其他影响因素  55
    5.1.6 存在问题  55
  5.2 转AtDCGS 基因的高蛋氨酸大豆  55-56
  5.3 转化嵌合体问题  56-57
第六章 结论  57-58
参考文献  58-68
致谢  68-69
作者简历  69

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 大豆
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