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农杆菌介导的高油酸大豆遗传转化方法的建立

作　者: 蔡一荣
导　师: 刘立侠
学　校: 东北师范大学
专　业: 植物学
关键词: 基因沉默高油酸,大豆子叶节转化系统胚尖转化系统茎尖转化系统
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 328次
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内容摘要

大豆遗传转化一直是限制大豆转基因研究的主要障碍。虽然国内外开展了很多年,并且建立起几种转化途径,可是都没有获得实质性的突破。所以为了使大豆基因工程育种工作更优更快发展,探索建立一套高效的转化途径对于大豆遗传转化有着重要的意义。本实验以吉林省主推大豆品种吉林35为材料,应用双链RNA基因沉默技术,利用根癌农杆菌EHA105介导大豆种子特异的油酸脱氢酶基因FAD2-1转化大豆。本实验根据近年来大豆遗传转化的研究进展,建立和优化了三种大豆遗传转化方法和系统:美国Iowa大学等成熟的农杆菌介导的大豆子叶节转化系统;刘海坤等新近报道的一种胚尖转化系统;根据张举仁等的玉米茎尖转化法,建立了大豆农杆菌介导茎尖直接转化系统。在实验过程中对比了子叶节、胚尖和茎尖三套大豆转化体系,分析了三套转化方法的效率和优缺点,并在此基础上获得了转基因大豆植株。实验结果表明,胚尖转化体系的再生效率比子叶节转化体系的高,对筛选剂—卡那霉素较为敏感,再生周期短,易获得抗性植株。胚尖转化体系比子叶节转化体系有许多优势,是今后大豆遗传转化优先选择的转化体系之一。茎尖转化体系相比较前两者来说,操作相对容易,获得转化苗快,但是,后期筛选工作量比较大。本实验对农杆菌介导的大豆遗传转化方法的进行了改良和创新,优化和建立了一套效率较高的大豆遗传转化体系。本实验研究的主要目标是筛选得到转基因的高油酸大豆材料,同时也希望通过这项研究建立起一整套成熟的大豆转化体系,为本实验室大豆遗传转化和转基因大豆研究提供基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
引言  8-15
  1. 大豆基因工程品质育种研究的概况  8-9
  2. 大豆高油酸基因工程育种研究进展  9-10
  3. 农杆菌介导大豆的遗传转化研究进展  10-12
    3.1 大豆遗传转化的现状  10
    3.2 农杆菌介导的大豆遗传转化  10-11
    3.3 农杆菌介导的大豆转化系统概述  11-12
      3.3.1 子叶节转化系统  11
      3.3.2 大豆胚尖转化系统  11
      3.3.3 大豆茎尖转化系统  11-12
  4. 农杆菌介导的大豆遗传转化的限制性因素  12-13
    4.1 大豆基因型  12
    4.2 农杆菌菌株  12
    4.3 不同受体材料  12
    4.4 其它因素  12-13
  5. 研究的目的意义、原理、主要内容  13-15
    5.1 实验的目的意义  13
    5.2 技术原理  13-14
    5.3 实验的主要内容  14-15
材料和方法  15-21
  1. 材料  15-16
    1.1 植物材料  15
    1.2 菌株和质粒  15
    1.3 试剂盒、酶类、PCR 引物  15
    1.4 培养基和试剂  15-16
  2. 实验方法  16-21
    2.1 农杆菌的检测和转化  16-17
      2.1.1 农杆菌电转化感受态的制作  16
      2.1.2 农杆菌热转化感受态的制作  16
      2.1.3 三亲杂交法转化农杆菌  16-17
        2.1.3.1 直接转化法  16-17
        2.1.3.2 滤膜固定法  17
      2.1.4 农杆菌质粒的提取  17
      2.1.5 酶切鉴定  17
    2.2 大豆种子的消毒方法  17
    2.3 子叶节转化系统  17-18
    2.4 胚尖转化系统  18-19
    2.5 茎尖转化系统  19
    2.6 转基因大豆的检测  19-21
      2.6.1 T0 代种子的抗性生根培养  19
      2.6.2 再生植株的PCR 检测  19-20
      2.6.3 子代种子油酸含量测定  20-21
结果与分析  21-30
  1 pSBHO-3 在农杆菌中的表达的鉴定  21-22
  2. 大豆遗传转化系统的技术路线  22-27
    2.1 影响农杆菌转化的因素  22-24
      2.1.1 大豆基因型的筛选  22-23
      2.1.2 抗生素的敏感性  23
      2.1.3 共培养时间  23-24
    2.2 子叶节转化系统建立技术路线  24
    2.3 胚尖转化系统的建立与优化  24-25
    2.4 茎尖转化系统的建立与优化  25-27
    2.5 子叶节和胚尖转化方法转化效率之比较  27
  3. 转基因材料的筛选  27-30
    3.1 抗性发芽实验  27
    3.2 PCR 检测  27-29
      3.2.1 T0 代材料的PCR 检测结果  27-28
      3.2.2 T1 代材料叶子PCR 检测结果  28
      3.2.3 T1 代材料种子PCR 检测结果  28-29
    3.3 油酸检测  29-30
讨论  30-33
  1. hpRNA 介导的基因沉默  30
  2. 大豆子叶节转化系统的讨论  30-31
  3. 胚尖转化系统的讨论  31
  4. 茎尖转化系统讨论  31-32
  5. 三种转化方法的比较  32-33
结论  33-34
参考文献  34-39
致谢  39

农杆菌介导的高油酸大豆遗传转化方法的建立

内容摘要

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