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第一部分食管癌患者源性的小鼠肿瘤模型的建立目地用新鲜组织和冻存后复苏的肿瘤组织,建立中国人食管癌患者源性的小鼠肿瘤模型(Patient Derived Tumor Tissue Xenograft Model PDECXM)研究平台。方法收集106例食管癌新鲜组织,每个标本分成三个部分：第一部分肿瘤组织在标本切下后立刻在无菌条件下放入含有抗菌素的50ml培养液收集管,并于2小时内送入动物房进行免疫缺陷小鼠(severe combined immunodeficiency, SCID)接种,在SCID生长的肿瘤再转接至裸鼠接种,第二部份肿瘤组织放入液氮快速冰冻保存用于DNA/RNA提取,第三部分肿瘤组织福尔马林固定及石蜡包埋用于HE及IHC分析。术后的食管癌新鲜组织(FO)在两小时内切成大约2mm3碎片,用病毒灭活的套针植入SCID裸鼠(F1)皮下,三个月内这例肿瘤组织在裸鼠成功生长并随后获得的异种移植瘤再次扩大植入新的雄性裸鼠,当裸鼠肿瘤体积生长至500-1000mm3,切取肿瘤,切成大约10mm3碎片,植入下一代裸鼠(F2)皮下继续生长。收集肯定传代的异种移植瘤并切成两部分：一部分放入—80℃冰箱中冷冻用于DNA/RNA提取,同时另一部分福尔马林溶液固定24小时后石蜡包埋,用于IHC分析。大量的F3-F5代裸鼠异种移植瘤碎组织放入液氮中保存用于将来肿瘤组织复苏模型重建。本实验用8-10周的裸鼠(Vital River, Beijing, China)来研究,所有实验裸鼠操作均符合实验动物管理小组认可的规范。结果106例食管癌组织接种和传代,接种成功57例,接种失败32例,观察阶段17例,最终46例传至F5及以上,成功率43.4%,3例液氮复苏裸鼠异种移植瘤碎组织种植,2例成功生长肿瘤,接种成功率为66.7%。结论本研究成功建立了PDECXM,冻存的中间阶段组织,复苏后仍可建立PDECXM,提示PDECXM可持续应用。第二部分组织芯片建立,免疫组化分析食管癌中HER-2蛋白表达目地观察HER-2蛋白在食管癌及癌旁组织中的表达情况。方法所有的食管癌原发肿瘤收集后固定10%福尔马林缓冲液中30分钟,肿瘤组织固定24小时后按常规操作执行。切片用苏木精及伊红染色经病理医师阅片确诊为食管癌。每个样本经病理医师阅片确诊,97例鳞状细胞癌,0例腺癌,3例腺鳞癌,3例神经内分泌癌,3例鳞癌,部分神经内分泌癌。构建组织芯片,IHC检测食管癌及癌旁组织HER-2表达情况。结果Her-2在正常食管组织中无表达(0%),而在癌组织及其间质中则表现为程度不等的细胞质染色,呈黄色或棕黄色颗粒。99例癌标本中,67例(67.7%)为阴性,13例(13.1%)为弱阳性+,19例(19.2%)为强阳性++或+++。87例食管正常标本中,均为阴性。19例强阳性中病理分级Ⅱ级8例,Ⅲ级11例,临床分期Ⅰ期1例,Ⅱ期13例,Ⅲ期5例。结论HER-2在食管癌中的阳性率较低,和食管癌恶性程度相关。第三部分FISH检测HER-2基因扩增状况目地用FISH方法检测食管癌中HER-2基因扩增状况,并分析HER-2基因扩增与蛋白表达的关系。方法构建组织芯片,所有食管癌组织芯片切成4μm切片用于FISH分析。用FISH方法检测食管癌组织中HER-2基因扩增状况。FISH结果判读用奥林斯巴BX61荧光显微镜在100X目镜下观察,每个样本50个肿瘤细胞。HER2/CEP17>2定义为HER FISH基因扩增。结果99例接种≥2代以上的病例中,FISH的方法检测HER-2基因扩增状况,6例(6.1%)HER-2拷贝数／17号染色体之比≥2的病例,病理分级Ⅱ级2例,IHC3+,Ⅲ级4例,IHC-ve 2例,IHC2+2例,临床分期Ⅱ期4例,Ⅲ期2例。结论食管癌中HER-2基因扩增的比例较低,与HER-2蛋白高表达相一致,和食管癌恶性程度相关。第四部分分子靶向药物Herceptin,化疗药物顺铂+5-FU在食管癌患者源性小鼠肿瘤模型中抗瘤活性的研究目地了解分子靶向药物Herceptin在食管癌患者源性小鼠肿瘤模型中(PDECXM)抗瘤活性以及与HER-2基因扩增和蛋白表达的关系。方法根据HER-2的免疫组化及FISH结果,选出三个食管癌异种移植物小鼠模型EC004,EC016,EC044来研究Herceptin和临床上标准化治疗药物之一顺铂+5-FU的抗瘤活性。研究中,所有荷瘤小鼠随机放入空白未治疗组,Herceptin治疗组,5-FU/顺铂治疗组,每组7只小鼠。到小鼠肿瘤生长至150-250mm3开始用药,按最大有效负荷剂量给药Hercepin (15 mg/kg,每周两次,ip),和5FU/Cisplatin (5FU:10mg/kg/ip/qd,5每周连用5天；Cisplatin:5mg/kg/iv,一周一次)。肿瘤体积变化用卡尺测径每周两次,计算公式V=(长+[宽]2)/2,和刚治疗时治疗体积相比较。荷瘤小鼠体重测量也每周两次,体重变化记录作为耐受变量。抑瘤率(%TGI=…)来评价抗瘤活性。结果HER-2拷贝数3.9,高表达组,Herceptin较对照组显著抑制肿瘤生长；HER-2拷贝数2.38,低表达组Herceptin不能抑制肿瘤生长；HER-2拷贝数1.52,阴性表达组Herceptin抑制肿瘤生长效果差。结论分子靶向药Herceptin能显著抑制HER-2高表达的食管鳞癌小鼠肿瘤生长,在HER-2不表达或低表达的食管鳞癌小鼠中疗效差,提示Herceptin在HER-2高表达的食管癌临床治疗中有显著价值。
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