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甲减大鼠心肌中mir-206和胰岛素样生长因子-1表达的关系

作　者: 张司蕾
导　师: 杜建玲
学　校: 大连医科大学
专　业: 内科学
关键词: 甲状腺功能减退 心肌 mir-206 胰岛素样生长因子-1
分类号: R581.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


研究背景及目的：甲状腺功能减退症（甲减，Hypothyroidism）可使全身多脏器受累，其中心血管系统最为明显，占大约70%-80%，包括心律失常、心包积液、心脏假性肥大、左室收缩和舒张功能下降、冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压等。甲减时TH（Thyroid Hormone，TH）分泌减少，可以在基因水平发挥作用影响心脏功能。微小RNA（microRNA，miRNA），是一类21-25nt单链非编码小分子RNA，具有高度的保守性、时序性和组织特异性，通常与靶mRNA的3非编码区（3Untranslated region，3-UTR）互补结合，在转录后阶段抑制其靶基因的表达TH。mir-206是一种心肌及骨骼肌特异性miRNA，在甲减时表达水平明显升高。作为mir-206的靶基因——胰岛素样生长因子-1（Insulin-like growthfactor-1，IGF-1）可以舒张血管、保护缺血心肌，并可促进心肌细胞肥大、增强心肌收缩力等。mir-206及IGF-1在甲减心肌病变中的发病机制未见相关报道。本研究通过观察甲减动物模型的心肌损伤情况，应用实时定量聚合酶链反应（Real Time polychain reaction，Real Time-PCR）检测心肌组织mir-206及其靶基因IGF-1的表达，Western blot检测IGF-1蛋白表达水平，从而探讨甲减致心肌病变的分子生物学机制。方法：1.大鼠分组及甲减模型的建立：30只SPF级雄性Wistar大鼠，体重200～220克，随机分成3组：正常对照组（C组，n=8）；甲减组（H组，n=22），行甲状腺全部切除手术，4周（4w）后测定血清促甲状腺激素（TSH）及总甲状腺素（TT4），TSH明显升高及TT4下降大鼠为甲减大鼠动物造模成功；甲减L-T4治疗组（HL组，n=8），甲减组大鼠造模成功后16w，于甲减组中随机选取8只，予皮下注射L-T4治疗8w。大鼠按组分笼喂养，饲以普通大鼠饲料。所有大鼠于实验28w时，予10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉，取心肌组织，一部分立即放入组织保存液中，并迅速转移至-70℃冰箱保存备用，另一部分置于4％多聚甲醛中固定24-48h，进行病理组织学样品制备。2.血清甲状腺功能指标测定：大鼠甲状腺切除术后4w眶后静脉丛取血、甲减造模成功后24w于心脏取血，分离血清，血清送至中国医科大学内分泌研究所，应用免疫荧光方法测定血清TSH及TT4。TT4测定的灵敏度为1μg/dl。3.心肌组织病理学检查：心肌组织H-E染色后，观察组织形态学变化。4.心肌组织α-MHC及β-MHC表达检测：提取各组大鼠心肌组织RNA，RealTime-PCR方法检测α-肌球蛋白重链（Moysin Heavy Chain，MHC）、β-MHC，比较C、H、HL三组心肌病变情况。5.心肌组织mir-206及IGF-1表达检测：提取各组大鼠心肌组织RNA，RealTime-PCR方法检测mir-206的表达及IGF-1的mRNA的表达。提取各组大鼠心肌组织蛋白，Western blot方法测定IGF-1的蛋白表达。结果：1.甲功与体重变化：甲状腺切除4w后，与C组比较，H组大鼠TSH（6.588±1.621vs0.053±0.014，P <0.01）及HL组大鼠TSH（4.955±1.011vs0.053±0.014，P <0.01）明显升高，H组TT4（1.745±1.007vs4.495±0.454，P <0.01）及HL组TT4（1.710±0.750vs4.495±0.454，P <0.01）明显减低，证实甲减造模成功；28w时，与C组比较，H组TSH（7.763±4.320vs0.083±0.040，P <0.01）明显升高，H组TT4（1.417±0.295vs3.945±0.713，P <0.01）减低，与H组比较，HL组TSH（0.420±0.150vs7.763±4.320，P <0.01）明显减低，HL组与C组比较TSH无差异（0.420±0.150vs0.083±0.040，P>0.05），HL组与H组比较TT4值（3.075±1.263vs1.417±0.295，P <0.01）升高，HL组与C组比较TT4值无差异（3.075±1.263vs3.945±0.713，P>0.05），证明皮下注射LT4治疗有效。28w时，大鼠体重与C组比较，H组（333.800±61.000vs530.500±39.300，P <0.01）和HL组（378.000±51.800vs530.500±39.300，P <0.01）均明显减低，HL组略高于H组，但差异无统计学意义（P>0.05）。2.心肌病理改变：C组大鼠心肌纤维排列规整，细胞核染色质均匀分布，核呈椭圆型，位居中央，心肌细胞之间间隙紧密；H组大鼠心肌中，心肌细胞排列紊乱，心肌细胞之间间隙增宽，心肌细胞萎缩；HL组大鼠心肌细胞也有萎缩，但与H组大鼠相比病变减轻。3.心肌组织α-MHC及β-MHC mRNA表达：与C组大鼠相比，H组大鼠心肌中α-MHC表达量（0.325±0.027vs1.008±0.137，P <0.01）明显减少，HL组α-MHC表达量（1.078±0.274vs1.008±0.137，P>0.05）略升高，与H组相比，HL组α-MHC表达量（1.078±0.274vs0.325±0.027，P <0.01）明显升高；与C组大鼠相比，H组β-MHC表达量（2.661±0.896vs1.027±0.265，P <0.05）明显升高，HL组β-MHC表达量（0.721±0.082vs1.027±0.265，P>0.05）略减低，H组比较，HL组β-MHC表达量（0.721±0.082vs2.661±0.896，P <0.01）明显下降。4.心肌组织mir-206表达量：28w时，与C组（1.044±0.352）大鼠相比，H组大鼠（3.695±1.516）的mir-206表达量升高至对照组的2.539倍，差异有统计学意义（P <0.05）；HL组（1.488±0.946）与C相比无明显差异（P>0.05），但与H组相比明显减少，差异有统计学意义（P <0.05）。5.心肌组织IGF-1的mRNA表达：C组（1.015±0.185）、H组（1.298±0.412）、HL组（1.029±0.397）间比较，心肌组织中IGF-1的mRNA表达水平均无显著差异（P>0.05）。6. IGF-1蛋白表达：28w时，与C组大鼠相比，H组大鼠（0.101±0.004vs0.149±0.003，P <0.01）IGF-1蛋白表达量明显下降，HL组IGF-1蛋白表达量（0.160±0.001vs0.149±0.003，P>0.05）无明显差异；与H组相比，HL组IGF-1表达量明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：1.甲减大鼠α-MHC表达减少，β-MHC表达升高；病理结果显示甲减组大鼠心肌中心肌细胞萎缩，出现明显心肌改变。2.甲减大鼠心肌中mir-206的表达升高，IGF-1的mRNA表达水平无明显变化，但IGF-1的蛋白表达水平下降，这种变化可以被L-T4所纠正。甲减大鼠心肌mir-206对IGF-1转录后抑制作用可能参与了甲状腺功能减退性心脏病变的发生。

全文目录


摘要  8-11
Abstract  11-15
前言  15-17
材料与方法  17-26
  1. 实验材料  17-19
    1.1 实验动物  17
    1.2 主要仪器  17-18
    1.3 主要试剂  18
    1.4 相关抗体  18-19
  2. 实验分组及处理  19-20
    2.1 实验动物分组  19
    2.2 甲减大鼠模型的建立  19-20
    2.3 心肌组织留取  20
  3. 血清甲状腺功能指标测定  20
  4. 病理组织学检查  20-21
  5. Real time PCR 检测α-MHC、β-MHC 及 IGF-1 mRNA  21-23
    5.1 总 RNA 提取  21
    5.2 RNA 的纯度鉴定及含量测定  21-22
    5.3 逆转录合成 cDNA  22
    5.4 SYBR Green PCR 扩增  22-23
  6. Realtime PCR 检测 mir-206 表达  23-24
    6.1 总 RNA 提取  23
    6.2 RNA 的纯度鉴定及含量测定  23
    6.3 逆转录合成 cDNA  23
    6.4 SYBR Green PCR 扩增  23-24
  7. Western blot 检测 IGF-1 蛋白表达水平  24-25
    7.1 western blot 试剂配方  24-25
    7.2 western blot 步骤  25
  8. 统计学分析  25-26
结果  26-30
  1. 大鼠体重  26
  2. 大鼠甲功  26-27
  3. 组织学改变  27
  4. 心肌α-MHC/β-MHC mRNA 表达  27-28
  5. 心肌 mir-206 表达  28-29
  6. 心肌 IGF-1 mRNA 表达  29
  7. 心肌 IGF-1 蛋白表达  29-30
讨论  30-34
结论  34-35
参考文献  35-39
综述  39-50
  参考文献  46-50
附录  50-51
致谢  51-52

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 甲状腺疾病 > 甲状腺机能减退症
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