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Identification and Characterization of Cis-Encoded Antisense RNAs Associated with the Replication Process of Salmonella Enterica Serovar Typhi

作　者: Isaac Dadzie
导　师: 黄新祥
学　校: 江苏大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 伤寒沙门菌 反义RNA DNA复制 高表达
分类号:
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


背景：细菌在遇到环境变化,尤其是在应激条件下,其非编码RNA在蛋白表达重编程过程中起到关键作用。这些非编码RNA参与细菌的各种胞内过程,包括耐酸、铁代谢、群体感应、镁和钙离子运输、毒力、ABC转运系统,外膜蛋白合成的抑制及转录因子的表达调控。在已知的非编码RNA中,对反式编码RNA的研究最为广泛。在细菌基因组内,虽然顺式编码的反式转录已被证明是广泛存在的,但它并未引起较多关注。这些反义RNA的合成、生理作用和作用机制至今仍是未知的。目的：细菌的复制体是由大量的酶组成的,这些酶相互间的协调作用得以完成染色体复制。通过对伤寒沙门菌转录组的高通量测序分析,发现一系列非编码RNA,其基因位于与细菌复制过程有关基因的互补链。本论文旨在研究这些反义RNA在细菌复制过程中的调节作用。方法：1.反义RNA转录起始及终止位点的确定：利用5’和3’RACE (末端快速扩增技术)确定各个反义RNA的转录起始及终止位点。RACE分析技术和Northern blot用以确定反义RNA的全长。2.菌株构建：构建了相关反义RNA的高表达菌株,其带有可被阿拉伯糖诱导的启动子。将反义RNA的基因全长片段通过PCR扩增后,克隆至载体pBAD-Myc-His A上,并将重组载体转入伤寒沙门菌野生株。RNase Ⅲ和RNase E缺陷株是由自杀质粒介导的同源重组法制备而成,Fur缺陷株是由λ-red重组法制备而成。3.细菌不同生长条件下反义RNA的表达特性分析：以Northern blot和qRT-PCR分析细菌在不同生长时期(包括迟滞期、对数期、稳态期,以不同OD600值表示)其反义RNA的表达特征。伤寒沙门菌在肠道或宿主细胞内可遇到不同的环境变化,同样的分析手段也被用以研究反义RNA在不同应激条件(包括酸、氧、高渗应激及铁缺乏)下的表达特性。4.分析反义RNA的高表达对其靶mRNA水平的影响：将高表达菌株培养至OD600值为0.6,不加或加入阿拉伯糖(终浓度为0.02%)继续培养5、10、20min,分别提取总RNA。利用qRT-PCR分析正义靶基因的mRNA水平。5.分析反义RNA的高表达对伤寒沙门菌生长的影响：测定伤寒沙门菌反义RNA高表达菌株和空质粒对照株在正常或不同应激条件下的生长,每隔1h测定一次OD600值,以确定细菌生长曲线。结果：1.反义RNA的鉴定：通过高通量测序发现的一系列与细菌复制有关的反义RNA,其转录起始和终止位点分别由5□-RACE和3□-RACE技术确定。选取其中两个反义RNA (dnaA的反义RNA AsdA及parC的反义RNA AspC)作进一步分析发现,AsdA全长540nt,其编码基因位于dnaA起始密码子下游514nt处,并向dnaA上游延伸16nt。全长871nt的AspC其编码基因与parC起始密码子下游410nt完全配对。Northern技术验证了这两种反义RNA在体外的表达。2.反义RNA的特点：与文献描述相似,Northern blot和qRT-PCR分析表明两种反义RNA AsdA和AspC主要在细菌生长的稳态期及酸、铁缺乏、高渗等刺激下表达。3.菌株：序列分析表明成功构建由pBAD质粒介导的AsdA和AspC高表达菌株及RNase Ⅲ、RNase E和fur缺陷株,这些菌株和之前一些已经构建好的菌株可用于观察AsdA和AspC在伤寒沙门菌中表达后的作用。4.功能分析：相对定量分析表明高表达AsdA和AspC这两个反义RNA都可以引起各自靶mRNA水平的显著提高。在RNase Ⅲ和RNase E缺陷株中对靶mRNA水平的检测进一步表明,反义RNA的表达提高了靶mRNA的稳定性,主要可能由于其保护靶mRNA免受核糖核酸酶的降解。5.对伤寒沙门菌生长的影响：与野生株相比,AsdA和AspC高表达菌株的生长更快,表明AsdA和AspC的表达可以促进细菌生长。而在应激条件下,AsdA和AspC的高表达同样可以促进细菌生长。6.对伤寒沙门菌动力的影响：动力实验表明,与野生株相比,高表达菌株的动力圈明显增大,这对于诸如伤寒沙门菌这样的致病菌对宿主的侵袭和定植十分重要。结论：本研究已经证实,在伤寒沙门菌中与复制过程相关的反义RNA AsdA和AspC,并不仅仅是基因转录的附属产物,而是可以对靶mRNA的稳定性起到重要作用。这种稳定性的增加最终会导致这些与复制过程有关的蛋白的大量表达,从而可使细菌在不利环境下更好的生长。

全文目录


ABSTRACT  7-10
摘要  10-15
ABBREVIATIONS  15-17
CHAPTER 1 Introduction  17-35
  1.1 Background  17
  1.2 Salmonella  17-19
  1.3 Bacterial non-coding RNAs  19
  1.4 Bacterial antisense RNAs  19-25
    1.4.1 Characteristics of cis-encoded antisense RNAs  20
    1.4.2 Mechanisms of action of cis-encoded antisense RNAs in bacteria  20-22
    1.4.3 Methods to find asRNAs  22-25
  1.5 DNA Replication in Bacteria  25-27
    1.5.1 Replication origin architecture  26
    1.5.2 Overview of bacterial replication initiation  26-27
    1.5.3 Elongation of DNA  27
    1.5.4 Termination of DNA replication  27
  1.6 Objectives  27-28
  1.7 Relevance of the study  28
  1.8 Experimental design  28-30
  1.9 References  30-35
CHAPTER 2 An antisense RNA AsdA increases the mRNA stability of the gene encoding the replicationinitiation protein of S. Typhi  35-75
  2.1 Introduction  35-36
  2.2 Materials and Methods  36-46
    2.2.1 Bacterial strains,plasmids,and growth conditions  36-37
    2.2.2 Construction of strains overexpressing the asRNAs  37-40
    2.2.3 Construction of strains overexpressing the asRNAs in RNase Ⅲ and RNase E mutants  40
    2.2.4 Construction of fur mutant  40
    2.2.5 5'-RACE  40-41
    2.2.6 3'-RACE  41-42
    2.2.7 Growth kinetic analysis  42-43
    2.2.8 Expression analysis of asRNA under stress conditions  43
    2.2.9 Overexpression analysis  43
    2.2.10 RNA extraction  43-44
    2.2.11 Quantitative RT-PCR  44
    2.2.12 Northern blot analysis  44
    2.2.13 Growth curves  44-46
  2.3 Results  46-66
    2.3.1 Identification and mapping of the 5' and 3' ends of AsdA  46-47
    2.3.2 Analysis of AsdA expression under different growth conditions  47-50
    2.3.3 Strain constructions  50-61
    2.3.4 Effect of overexpression of asdA on dnaA mRNA level  61-63
    2.3.5 Effect of overexpression of asdA on the growth of S. Typhi  63-66
  2.4 Discussion  66-70
  2.5 References  70-75
CHAPTER 3 Identification and characterization of a cis antisense RNA of parC gene encoding DNAtopoisomerase Ⅳ of S. Typhi  75-97
  3.1 Introduction  75-77
  3.2 Materials and Methods  77-81
    3.2.1 Bacterial strains and culture conditions  77
    3.2.2 Strain and plasmid construction  77-78
    3.2.3 5'-and 3'-RACE  78
    3.2.4 RNA extraction  78-79
    3.2.5 Northern blot analysis  79
    3.2.6 Quantitative RT-PCR  79-80
    3.2.7 Growth curves  80
    3.2.8 Motility assay  80-81
  3.3 Results  81-90
    3.3.1 Identification of antisense RNA complementary to parC mRNA  81-82
    3.3.2 Expression of AspC under different growth conditions  82-84
    3.3.3 Strain constructions  84-85
    3.3.4 Effect of overexpression of AspC on parC mRNA level  85-88
    3.3.5 Effect of overexpression of AspC on the growth of S. Typhi  88-90
  3.4 Discussion  90-94
  3.5 References  94-97
GENERAL CONCLUSIONS  97-99
ACKNOWLEDGEMENTS  99-101
LIST OF PUBLICATIONS  101-103
APPENDICES  103-105

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