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结核分枝杆菌GlmU在耻垢分枝杆菌中的高表达及反义RNA表达系统的优化

作　者: 宁冬青
导　师: 马郁芳
学　校: 大连医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 结核分枝杆菌 UDP-N-乙酰葡萄糖胺 glmU基因 反义RNA 四环素诱导
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


由结核分枝杆菌引起的结核病是严重危害人类健康的三大疾病之一。世界卫生组织(World Health Organization, WHO)的报告显示,世界人口的三分之一感染过结核杆菌,全世界每20秒就有一人死于结核病。由于耐多药(multi drug resistant, MDR)甚至是广泛耐药(extensive drug resistant, XDR)结核杆菌的出现,许多一线甚至一些二线抗结核药物都无法有效治疗结核病,因此寻找新的抗结核药物迫在眉睫。结核分枝杆菌的细胞壁在其生存和增殖过程中起着重要的作用,其核心结构由肽聚糖、阿拉伯半乳聚糖、分枝菌酸三种组分连接组成。其中分枝菌酸和聚阿拉伯糖半乳糖通过衔接双糖(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺)共价连接到肽聚糖分子上。UDP-N-乙酰葡糖胺是N-乙酰葡糖胺的糖基供体,在UDP-N-乙酰葡糖胺的生物合成中,glmU基因编码的GlmU蛋白具有葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性和N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷转移酶活性,催化最后两步反应。本实验室张文利通过基因敲除的方法证明了glmU基因为分枝杆菌生长必需基因,因此,GlmU可作为很好的抗结核新药靶标。本实验已建立了测定GlmU酶活性的方法,并以此作为筛选抗GlmU酶抑制剂的分子模型。因此,我们需要构建能上调GlmU蛋白表达的细胞模型来进一步筛选抗GlmU酶抑制剂。另外,为了进一步研究GlmU蛋白表达的下降对分枝杆菌细胞壁结构的影响,我们需要构建能下调GlmU蛋白表达的系统,来下调GlmU蛋白表达水平,并用本实验制备的抗GlmU的多克隆抗体对glmU反义RNA表达系统所表达的GlmU水平进行检测。本论文的目的是:(1)在宿主菌mc2155中高表达Tb GlmU,并用检测GlmU酶蛋白活性的方法来鉴定Tb GlmU在耻垢中的高表达;(2)优化受四环素诱导的glmU反义RNA表达系统,用本实验室制备的GlmU多克隆抗体检测GlmU蛋白的表达水平;(3)用扫描电镜观察GlmU表达减弱的耻垢分枝杆菌形态学变化。本论文所获得的结果如下:1.表达载体pVV2-Tb glmU的构建用Nde I和BamH I双酶切pET16b-Tb glmU质粒,回收和纯化glmU基因,将其连接到pVV2表达载体的Nde I和BamH I位点,构建pVV2-Tb glmU表达质粒。GlmU蛋白的N端与质粒上的组氨酸标签形成融合蛋白。2. Tb GlmU蛋白在耻垢分枝杆菌mc2155中的高表达及鉴定将pVV2-Tb glmU质粒转化到mc2155感受态细胞中使其表达GlmU蛋白。用超声方法破碎携带pVV2-Tb glmU的mc2155菌,对上清和沉淀组分进行SDS-PAGE和Western blotting分析,结果表明Tb GlmU蛋白在mc2155中可溶性表达。并利用其酶活性检测方法来鉴定GlmU在耻垢分枝杆菌中的高表达。3.反义RNA表达载体pMind-Sm glmU(360bp)-AS的构建用Nde I和BamH I双酶切pMD18-Sm glmU(360bp)质粒,回收和纯化glmU基因片段,将其连接到pMind反义表达载体的Nde I和BamH I位点,构建pMind-Sm glmU(360bp)-AS反义表达质粒。4. glmU反义RNA的诱导表达与GlmU蛋白的检测分别用0ng/ml、5ng/ml、20 ng/ml的四环素诱导携带pMind-Sm glmU(360bp)-AS表达载体的mc2155菌株表达反义RNA,绘制细菌生长曲线,并用本实验室制备的GlmU多克隆抗体检测GlmU蛋白的表达水平。结果表明20 ng/ml四环素对mc2155/ pMind-Sm glmU(360bp)-AS的生长有明显的抑制作用,Western blotting结果表明经过20ng/ml四环素诱导的mc2155/ pMind-Sm glmU(360bp)-AS GlmU蛋白的表达明显减少,证明了glmU反义RNA下调了耻垢分枝杆菌GlmU表达水平。5.经20ng/ml四环素诱导的mc2155/ pMind-Sm glmU(360bp)-AS菌株细胞形态的变化将经20ng/ml四环素诱导的mc2155/ pMind-Sm glmU(360bp)-AS菌株细胞用扫描电镜观察其细胞形态。结果显示生长了48小时后,菌体表面出现明显的凸起,甚至溶胀,菌体轮廓亦不清晰,似乎都粘连在一起。说明本实验优化的反义RNA表达系统发挥了下调GlmU表达的作用,更进一步说明了GlmU蛋白对细胞壁完整性有影响。结论:1.在耻垢分枝杆菌中高表达出可溶性Tb GlmU蛋白,构建了能上调GlmU表达的菌株,为筛选Tb GlmU酶抑制剂提供了细胞模型。2.优化了glmU反义RNA表达系统,构建了能下调GlmU表达的菌株,研究了GlmU表达的减少对耻垢分枝杆菌细胞壁结构的影响。

全文目录


一、摘要  6-12
  （一） 中文摘要  6-9
  （二） 英文摘要  9-12
二、文献综述  12-22
  （一） 综述  12-20
  （二） 参考文献  20-22
三、正文  22-51
  （一） 前言  22-24
  （二） 材料和方法  24-34
  （三） 结果  34-44
  （四） 讨论  44-47
  （五） 结论  47-49
  （六） 参考文献  49-51
四、致谢  51

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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