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丰产梨α-法尼烯合成酶基因RNAi和反义表达载体的构建及遗传转化研究

作　者: 高玉娇
导　师: 张元湖
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物学
关键词: 梨虎皮病 α-法尼烯合成酶 hpRNA 反义RNA 载体构建
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

虎皮病是苹果、梨在低温贮藏中后期发生的最严重的生理病害,其主要症状是:在果实表面出现褐色至深褐色的不规则、凹陷形病斑,形如烫伤,故又称褐烫病。此病一般只发生于果皮表层细胞,严重时也能危及果肉细胞,极大的影响了果实的品质。众多的实验表明,α-法尼烯与虎皮病的发生有关,α-法尼烯的生物合成是通过类异戊二烯途径中的甲羟戊酸途径,调控此途径的酶包括3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)、法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)、α-法尼烯合成酶(AFS)。其中AFS是调控α-法尼烯合成的最直接的限速酶,它催化法尼基焦磷酸(FPP)转变为α-法尼烯。近年来通过α-法尼烯合成酶来研究虎皮病的分子机制已经成为国内外研究的热点问题。本研究根据α-法尼烯合成酶基因全长序列设计特定引物,构建RNAi载体和反义表达载体,利用根癌农杆菌介导转化丰产梨,以期进一步研究α-法尼烯合成酶的功能;同时,研究影响梨遗传转化过程的影响因素,完善了梨再生体系。主要结果如下:1、采用TRIZON法从丰产梨再生苗中提取了高质量的RNA,经过RT-PCR扩增得到了构建表达载体的长、短片段。2、利用RT-PCR技术获得了来源于α-法尼烯合成酶基因(PFS)编码区的两个基因片段,反向连接,经PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定,验证其序列和设计的相一致,成功构建了抑制α-法尼烯合成酶基因表达的RNAi表达载体PBI-L-S。3、成功构建了反义表达载体PBI-PFS-L,然后借助农杆菌介导法转化梨再生苗。将RNAi载体和反义载体遗传转化到丰产梨植株中,经过PCR检测初步确定两个载体已转入丰产梨植株苗中。4、通过研究抗生素浓度、AS等因素的影响,确定了遗传转化过程中的影响因子。

全文目录

中文摘要  9-11
英文摘要  11-13
引言  13-23
  1.1 虎皮病与α-法尼烯  13-14
  1.2 导致虎皮病的生理生化因素  14-16
    1.2.1 虎皮病的防治  14-16
  1.3 RNA 干扰  16-21
    1.3.1 RNAi 的产生和发展  17
    1.3.2 RNAi 与其他基因表达抑制技术的比较  17-18
    1.3.3 RNAi 的作用机制  18-19
    1.3.4 RNAi 表达载体的构建设计原则  19-20
    1.3.5 RNAi 技术的应用  20-21
      1.3.5.1 基因功能分析  20-21
      1.3.5.2 植物抗病的研究  21
      1.3.5.3 新药物的研究和开发  21
  1.4 反义RNA 技术的原理及作用机制  21-23
    1.4.1 反义RNA 技术在植物上的应用  22-23
2 梨组织培养及遗传转化研究进展  23-31
  2.1 影响梨叶片高效再生的因素  24-28
    2.1.1 基因型  24
    2.1.2 培养基  24
    2.1.3 培养基和植物生长调节剂  24-25
    2.1.4 卡那霉素对叶片再生的影响  25-26
    2.1.5 头孢霉素(Cef)对叶片再生的影响  26
    2.1.6 AgNO_3 对叶片再生的影响  26-27
    2.1.7 AS 对转化效率的影响  27
    2.1.8 叶片放置方式  27-28
    2.1.9 培养环境对器官形态建成的影响  28
  2.2 梨的遗传转化  28-31
    2.2.1 影响转基因频率的因素  29-31
      2.2.1.1 基因型  29
      2.2.1.2 菌株  29-30
      2.2.1.3 标记基因  30
      2.2.1.4 抗菌肽的活性及其稳定性  30
      2.2.1.5 Vir 区基因活化对转化的影响  30-31
    2.2.2 检测方法  31
      2.2.2.1 GUS 活性检测  31
      2.2.2.2 PCR 检测  31
      2.2.2.3 Southern 杂交检测  31
3 材料与方法  31-49
  3.1 实验材料  31-33
    3.1.1 植物材料  31-32
    3.1.2 菌株与质粒  32
    3.1.3 酶及生化试剂  32
    3.1.4 PCR 引物  32-33
  3.2 实验方法  33-41
    3.2.1 RNA 的提取方法  33-34
      3.2.1.1 CTAB 法提取梨果皮总RNA  33
      3.2.1.2 利用TRIZOL 试剂盒提取RNA  33-34
    3.2.2 检测RNA 纯度  34-35
      3.2.2.1 配制药品  34-35
    3.2.3 RNA 电泳  35-36
      3.2.3.1 药品配制  35
      3.2.3.2 凝胶的制备  35-36
    3.2.4 RNA 反转录  36
    3.2.5 PCR 扩增  36-37
    3.2.6 连接反应  37
    3.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备  37-38
    3.2.8 转化及克隆筛选  38-39
    3.2.9 碱法小量提取质粒DNA 及酶切鉴定  39
    3.2.10 酶切鉴定  39-40
    3.2.11 用玻璃奶方法回收纯化DNA 片段  40-41
  3.3 植物表达载体的构建  41-42
    3.3.1 碱法大量提取质粒DNA  41-42
    3.3.2 序列测定  42
  3.4 RNAi 表达载体PBI-L-S 的构建  42-47
    3.4.1 PCR 引物设计  42-43
    3.4.2 PCR 扩增  43
    3.4.3 发夹结构的构建  43-47
  3.5 反义表达载体PBI-L 的构建  47-48
    3.5.1 根癌农杆菌EHA105 感受态细胞的制备及转化  48
      3.5.1.1 农杆菌感受态细胞的制备  48
      3.5.1.2 冻融法转化农杆菌  48
  3.6 抗生素对叶片再生的影响  48-49
    3.6.1 卡那霉素选择压的确定  48-49
    3.6.2 抑菌抗生素对丰产梨离体叶片再生的影响  49
    3.6.3 抑菌抗生素浓度的确定  49
    3.6.4 AgNO_3 浓度的确定  49
4 结果与分析  49-59
  4.1 植物表达载体的构建  49-52
    4.1.1 RNAi 表达载体PBI-L-S 的构建  49-50
      4.1.1.1 正、反片段的扩增及酶切鉴定  49-50
    4.1.2 反义表达载体PBI-L 的构建  50-52
  4.2 遗传转化  52-56
    4.2.1 卡那霉素对叶片再生的影响  52-53
    4.2.2 卡那霉素对组培苗新梢增殖的影响  53
    4.2.3 头孢霉素(Cef)对叶片再生的影响  53-54
    4.2.4 羧苄青霉素(Carb)对叶片再生的影响  54-55
    4.2.5 AgNO_3 对叶片再生的影响  55-56
    4.2.6 AS 对转化效率的影响  56
  4.3 转基因植株苗的检测  56-59
5 讨论  59-61
6 结论  61-62
参考文献  62-72
附录  72-74
致谢  74-75
攻读学位期间发表的学术论文目录  75

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