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短C肽甘精胰岛素的研制

作　者: 杨华君
导　师: 范开
学　校: 重庆理工大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 甘精胰岛素上游高表达蛋白纯化
分类号: R94
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

胰岛素疗效确切,上市己长达八十年,至今仍是各型糖尿病,尤其是中、重度糖尿病患者维持正常血糖水平和治疗糖尿病相关酮症、酸血症及糖尿病性昏迷不可或缺的药物,临床地位十分重要。但是,传统的短中效胰岛素具有作用时间不够长,需要每天多次注射,病人依从性差;皮下注射有吸收峰值;睡前注射有增加夜间低血糖危险等缺点。甘精胰岛素作为一种长效胰岛素,具有每天注射1次即能维持24小时;吸收稳定,吸收后无峰值,减少低血糖发生;具有良好的生物利用度,血糖控制稳定的优点。长效是未来胰岛素的发展方向。研究目的:构建含有短C肽EAEDKR的甘精胰岛素原PET32a-glargine的大肠杆菌表达系统,筛选高效分泌表达的origami(DE3)plysS及origami(DE3)重组工程菌,获得glargine(甘精胰岛素)重组蛋白。建立PET32a-glargine/origami(DE3)plysS及PET32a-glargine/origami(DE3)由上游构建至破菌、纯化、酶切的生产工艺,得到具有正确活性结构的纯度较高的glargine。研究方法:①PET32a-glargine的上游构建: 1)全基因合成含有短C肽EAEDKR的甘精胰岛素原基因序列。2)利用PET32a质粒上的BamH I及Hind III酶切位点,将glargine插入到PET32a中,构建PET32a-glargine重组质粒。3)将重组质粒转入Jm109工程菌中,筛选高拷贝质粒。4)将高拷贝质粒转入origami(DE3)plysS及origami(DE3)重组工程菌中。5)利用不同筛选压力,诱导剂,诱导方法来获得高表达origam(iDE3)plysS及origami(DE3)菌株。6)优化条件,发酵罐发酵。②PET32a-glargine/origami(DE3)plysS及PET32a-glargine/origami(DE3)破菌工艺的研究:测试在不同PH及各种破菌液条件下的破菌情况,选择破菌完全且大多以可溶方式存在的破菌条件。③Trx-glargine的纯化与酶切:发酵液经Ni柱及Q柱纯化后,以胰酶酶切,HPLC监测酶切效果。并以反相C-18柱回收,质谱鉴定确定结构。研究结果:①SDS-PAGE、HPLC和质谱分析出glargine的分子量与理论分子量相符。②PET32a-glargine/origami(DE3)表达量高,可达1g/L.③回收率低,仅为40%,但明显高于以往报道。结论:本研究实现了含短C肽的甘精胰岛素原glargine在大肠杆菌系统中的高表达,通过一系列的纯化及酶切最终得到具有生物学活性的glargine目的蛋白。但本方法研究发现虽然PET32a系统可得到较高表达的目的蛋白,但仍有部分蛋白以非可溶性方式存在,质粒中含有的Trx帮助复性有一定意义,回收率高于以往报道。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
英文缩略表  10-12
1 绪论  12-26
  1.1 前言  12-13
    1.1.1 糖尿病  12
    1.1.2 研究背景  12-13
  1.2 胰岛素的研究现状  13-17
    1.2.1 胰岛素的结构与生物学功能  13-14
    1.2.2 胰岛素及其类似物的研究  14-17
  1.3 大肠杆菌系统表达外源基因的一般策略  17
  1.4 生产重组人胰岛素的方法  17-18
  1.5 C 肽  18-19
  1.6 包涵体及其复性  19-22
  1.7 PET 系统  22-23
  1.8 研究目的  23
  1.9 研究内容和技术路线  23-26
2 短 C 肽甘精胰岛素原基因的设计及表达构建  26-36
  2.1 引言  26
  2.2 短C 肽甘精胰岛素原的设计  26-29
  2.3 PET32a-glargine 质粒的构建  29-36
    2.3.1 材料与方法  29-34
    2.3.2 结果与分析  34-36
3 短 C 肽甘精胰岛素原在大肠杆菌中的表达与鉴定  36-44
  3.1 引言  36-37
  3.2 材料与方法  37-41
    3.2.1 材料  37-39
    3.2.2 方法  39-41
  3.3 结果  41-43
    3.3.1 PET32a-glargine 重组子的鉴定  41
    3.3.2 Trx-glargine 融合蛋白的表达与鉴定  41-43
  3.4 讨论  43-44
4 Trx-glargine 的纯化、酶切及鉴定  44-54
  4.1 引言  44
  4.2 材料与方法  44-48
    4.2.1 材料  44-45
    4.2.2 方法  45-48
  4.3 结果  48-51
    4.3.1 Ni 柱及Q 柱纯化结果  48-49
    4.3.2 酶切方法研究结果  49-51
  4.4 讨论  51-54
    4.4.1 重组胰岛素纯化的一般工艺  51-52
    4.4.2 结论  52-54
5 结论与展望  54-56
  5.1 结论  54
  5.2 本文的创新性  54
  5.3 展望  54-56
致谢  56-58
参考文献  58-62
个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果  62-63
附图  63

短C肽甘精胰岛素的研制

内容摘要

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