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RpoE对伤寒沙门菌高渗应激下的基因表达调节作用

作　者: 杜鸿
导　师: 黄新祥
学　校: 江苏大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 伤寒沙门菌 rpoE 生长曲线基因芯片基因表达调节
分类号: R378.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:RpoE是肠道致病菌中重要的一个sigma因子,能启动许多基因的表达;本研究拟观察伤寒沙门菌响应环境应激时RpoE是否发挥作用以及高渗应激早期RpoE对其他基因表达调节的研究。方法:(1)采用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌rpoE缺陷变异株。根据伤寒沙门菌rpoE基因序列,设计PCR特异性引物,并在引物5′-末端加上需要的酶切位点。扩增rpoE基因上、下游片段,用BglⅡ消化后,定向连接成rpoE基因的缺损性同源性核苷酸片段。将此片段胶回收后导入自杀质粒pGMB151的BamHⅠ酶切位点,将阳性质粒用电击法导入伤寒沙门菌野生株(GIFU10007),进行同源重组。用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为rpoE基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。(2)以生长时间为横坐标,OD值为纵坐标绘制生长曲线,对比rpoE基因缺陷变异株与野生株在高渗、酸、氧、胆汁应激条件下的生存情况。(3)利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,体外模拟高渗环境应激,在低渗(50 mmol/L NaCl)LB培养液中分别培养伤寒沙门菌野生株和rpoE基因缺陷变异株4h(37℃,250r/min)至对数生长期,后转入高渗(300 mmol/L NaCl)LB培养液中在同样条件下继续培养,在高渗应激早期(30min),分别提取伤寒沙门菌野生株和rpoE基因缺陷变异株的总RNA,反转录成cDNA并标记荧光(cy3或cy5),与基因组芯片杂交,扫描后根据荧光信号分析各基因转录表达水平,比较伤寒沙门菌野生株和rpoE基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达谱差异;选择部分差异表达基因设计并合成特异性引物,进行实时定量RT-PCR,以验证DNA芯片分析结果。结果:(1)经PCR及序列分析证实变异株中rpoE基因缺失了288个碱基,表明成功构建伤寒沙门菌rpoE基因缺陷变异株;(2)生长曲线提示rpoE基因缺陷变异株在高渗、酸、氧应激条件下生存能力明显弱于野生株(P<0.05);在胆汁应激下生存能力与野生株比较没有明显差异。(3)基因芯片分析:高渗应激30分钟后,相比野生株,rpoE基因缺陷株有135个基因表达明显变化,其主要涉及部分热休克蛋白、鞭毛蛋白、侵袭蛋白、外膜蛋白及一些酶类、双组分调控系统phoP/phoQ和大量未知功能的推测蛋白。选取其中部份差异表达基因利用RT-PCR进行验证,结果显示所选基因与基因芯片的表达情况一致。结论:成功构建了伤寒沙门菌rpoE基因缺陷株,在高渗、酸、氧应激条件下rpoE基因缺陷株的生存能力明显弱于野生株(P<0.05);RpoE在伤寒沙门菌高渗应激早期的基因表达调节中发挥重要作用。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第一章绪论  12-18
  1.1 伤寒沙门菌简介  12-13
  1.2 RpoE因子  13-14
  1.3 其他细菌中对RpoE因子的研究  14-16
  1.4 伤寒沙门菌中对RpoE因子的研究现状  16-18
第二章本论文研究的目的、方法、实验方案的设计  18-20
  2.1 研究目的  18
  2.2 研究方法  18
  2.3 实验方案  18-20
第三章伤寒沙门菌rpoE缺陷株的构建及鉴定  20-32
  3.1 材料与方法  20-26
  3.2 结果  26-30
  3.3 讨论  30-32
第四章 rpoE缺陷变异株与野生株生存能力对比  32-40
  4.1 材料与方法  32-34
  4.2 结果  34-38
  4.3 讨论  38-40
第五章高渗应激早期RpoE因子对其它基因表达影响  40-54
  5.1 材料与方法  40-45
  5.2 结果  45-50
  5.3 讨论  50-54
第六章实时定量PCR验证芯片分析结果  54-60
  6.1 材料  54-55
  6.2 方法  55-56
  6.3 结果  56-57
  6.4 讨论  57-60
第七章主要结论及展望  60-62
  7.1 主要结论  60
  7.2 展望  60-62
【参考文献】  62-68
英文缩写索引  68-70
致谢  70-72
攻读硕士学位期间发表的文章  72

RpoE对伤寒沙门菌高渗应激下的基因表达调节作用

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