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PmrA对伤寒沙门菌高渗应激后期基因表达调节作用

作　者: 高宇琳
导　师: 黄新祥
学　校: 江苏大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 伤寒沙门菌 PmrA 基因芯片 高渗应激 侵袭
分类号: R378.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的PmrA为伤寒沙门菌双组份调节系统的效应调节蛋白,在高渗应激的后期其基因表达明显下调。本研究的目的是进一步探讨伤寒沙门菌调节因子PmrA在高渗应激后期对基因表达调节的影响。方法(1)伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株制备:采用自杀质粒pGMB151介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌调节因子PmrA的基因缺陷变异株,根据伤寒沙门菌pmrA基因序列设计引物,扩增pmrA基因上、下游同源性片段,定向连接成pmrA基因缺损型同源核苷酸片段,并与自杀质粒pGMB151相连后经电击法导入伤寒沙门菌野生株,在5%蔗糖LB平板上进行同源重组,通过筛选获得pmrA基因缺陷变异株;(2)伤寒沙门菌基因转录表达谱分析:利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,体外模拟高渗环境应激,在低渗(50 mmol/L NaCl)LB培养液中分别培养伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株4h(37℃,250r/min)至对数生长期,后转入高渗(300 mmol/L NaCl)LB培养液中在同样条件下继续培养,在高渗应激后期(120min),分别提取伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株的总RNA,反转录成cDNA并标记荧光(cy3或cy5),与基因组芯片杂交,扫描后据荧光信号分析各基因转录表达水平,比较伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期的基因表达谱差异;(3)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析:选择部分表达差异显著的基因,设计并合成特异性引物,进行实时荧光定量PCR,验证DNA芯片分析结果。,结果(1)PCR及序列分析证实,pmrA基因缺陷变异株中pmrA基因351bp被6bp取代,表明成功构建pmrA基因缺陷变异株;(2)基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期有81个基因表达上调,有22个基因表达下调。其主要涉及ABC转运系统相关蛋白、鞭毛蛋白、侵袭蛋白、外膜蛋白及一些酶类等;(3)对pmrA基因缺陷变异株中表达差异基因(yliC,putA),利用实时荧光定量PCR进行分析其mRNA水平,结果显示其在pmrA基因缺陷变异株和野生株中差异与基因芯片分析结果基本一致。结论成功构建伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株;PmrA在伤寒沙门菌高渗应激后期,对基因表达调节与物质转运及侵袭力的提高等发挥重要作用。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第一章 绪论  12-20
  1.1 伤寒沙门菌简介  12
  1.2 双组份调节系统  12-13
  1.3 PmrA-PmrB双组份系统  13-17
  1.4 高渗应激与PmrAB双组份调节系统  17-18
  1.5 本课题研究内容  18-20
第二章 本论文研究的目的、方法、实验方案的设计  20-22
  2.1 研究目的  20
  2.2 研究方法及技术  20
  2.3 实验方案的设计  20-22
第三章 伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株的构建及鉴定  22-38
  3.1 材料与方法  22-31
    3.1.1 材料  22-23
    3.1.2 方法  23-31
  3.2 结果  31-35
  3.3 讨论  35-38
第四章 PmrA在高渗应激后期对基因表达影响  38-52
  4.1 材料与方法  38-43
    4.1.1 材料  38-40
    4.1.2 方法  40-43
  4.2 结果  43-48
  4.3 讨论  48-52
第五章 实时荧光定量PCR验证基因芯片结果  52-58
  5.1 材料  52-53
  5.2 方法  53-54
  5.3 结果  54-56
  5.4 讨论  56-58
第六章 主要结论及展望  58-60
  6.1 主要结论  58
  6.2 展望  58-60
参考文献  60-68
英文缩写索引  68-70
致谢  70-72
攻读硕士学位期间发表的文章及学术交流  72

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌 > 肠道杆菌 > 伤寒杆菌
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