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伤寒沙门菌mig-14基因功能研究

作　者: 夏秋风
导　师: 黄新祥
学　校: 江苏大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 伤寒沙门菌 Mig-14 高渗应激 基因芯片 基因表达调节
分类号: R378.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的Mig-14是伤寒沙门菌的一种内膜结合蛋白,在高渗应激时期表达显著增高,蛋白结构分析提示它可能为一种调节蛋白。本研究目的是揭示伤寒沙门菌Mig-14在高渗应激下对基因表达的调节作用。方法1.用自杀质粒介导的同源重组方法,制备伤寒沙门菌mig-14基因缺陷变异株。根据伤寒沙门菌mig-14基因序列,设计PCR特异性引物,并在引物5’末端加上需要的酶切位点。扩增mig-14基因上、下游DNA片段,用BglⅡ消化后,定向连接成mlg-14基因的缺损性同源性核苷酸片段。将此片段胶回收后克隆至自杀质粒pGMB151的BamH I位点,再将经酶切和特异性PCR鉴定的阳性重组自杀质粒用电击法导入伤寒沙门菌野生株,用蔗糖诱导同源重组。用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为mig-14基因缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确证。2.利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,在体外模拟高渗应激环境,向在低渗培养基中培养至对数生长期的菌液中加入NaCl,使其浓度从50 mM增加到300 mM。在高渗应激早期(30min)分别提取伤寒沙门菌野生株和mig-14基因缺陷变异株总RNA,反转录成cDNA并加标荧光(cy3或cy5),与基因组芯片进行杂交,扫描分析,比较伤寒沙门菌野生株和mig-14基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达谱差异,并选择部分差异表达基因利用实时荧光定量RT-PCR验证,以分析Mig-14在高渗应激下对基因表达的调节作用。3.在中性和酸性条件下对mig-14缺陷株、phoP缺陷株和野生株做多粘菌素B杀伤实验,以确证在S.Typhi GIFU10007野生株中mig-14是否能拮抗多粘菌素B的杀伤作用。结果1.成功制备伤寒沙门菌mig-14缺陷株,经PCR及序列分析证实,mig-14变异株中mig-14基因的编码区有390个碱基缺失,且没有发生极性突变。2.基因表达谱比较分析结果表明,在高渗应激早期mig-14变异株与野生株相比有77个基因表达下调和72个基因表达上调,其中包括鞭毛蛋白、侵袭蛋白、外膜蛋白、代谢酶类以及一些未知功能的蛋白。选取其中部份差异表达基因cydA、invF、pagP和treC,利用实时荧光定量RT-PCR进行验证,结果显示所选基因的mRNA水平与基因芯片分析的结果情况一致。3.在中性培养基条件下,多粘菌素B对三种菌株的杀伤效果基本相同。在酸性条件下mig-14缺陷株确实对多粘菌素B的敏感性比野生株稍高,但敏感程度比phoP缺陷株低很多。结论伤寒沙门菌Mig-14为一种内膜结合的调节蛋白,在高渗应激早期主要参与调节鞭毛装配过程以及细菌的物质和能量代谢。

全文目录


摘要  5-8
ABSTRACT  8-13
第一章 绪论  13-17
  1.1 伤寒沙门菌简介  13-14
  1.2 沙门菌mig-14基因研究简介  14
  1.3 伤寒沙门菌基因表达调节与抗多粘菌素B的机制  14-17
第二章 本论文研究的目的、方法、实验方案的设计  17-19
  2.1 研究目的  17
  2.2 研究方法及技术  17
  2.3 实验方案的设计  17-19
第三章 伤寒沙门菌mig-14缺陷株的构建及鉴定  19-35
  3.1 材料与方法  19-28
    3.1.1 材料  19-20
    3.1.2 方法  20-28
  3.2 结果  28-33
  3.3 讨论  33-35
第四章 高渗应激早期野生株和mig-14缺陷株基因表达谱差异分析  35-47
  4.1 材料与方法  35-39
    4.1.1 材料  35-37
    4.1.2 方法  37-39
  4.2 结果  39-45
  4.3 讨论  45-47
第五章 实时荧光定量RT-PCR验证基因芯片分析的部分结果  47-53
  5.1 材料与方法  47-49
    5.1.1 材料  47-48
    5.1.2 方法  48-49
  5.2 结果  49-51
  5.3 讨论  51-53
第六章 多粘菌素B抗性实验  53-57
  6.1.材料与方法  53-54
    6.1.1 材料  53
    6.1.2 方法与步骤  53-54
  6.2.结果  54-55
  6.3.讨论  55-57
第七章 主要结论及展望  57-59
  7.1 主要结论  57
  7.2 展望  57-59
【参考文献】  59-63
英文缩写索引  63-65
致谢  65-67
攻读硕士学位期间发表的文章及学术交流  67

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌 > 肠道杆菌 > 伤寒杆菌
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