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玉米幼胚胚性愈伤组织诱导过程中重要miRNA及靶基因的功能研究

作　者: 江舟
导　师: 潘光堂
学　校: 四川农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 玉米胚性愈伤组织 高通量测序 降解组测序 荧光定量PCR miRNA
分类号: S513
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


传统的转基因玉米新品种培育需经遗传转化、自交纯合、杂交组配及回交转育几个重要环节,通常从转化体自交纯合到回交转育获得转基因骨干自交系至少需要3～6年。作为世界玉米转基因育种最广泛使用的外植体——玉米胚性愈伤组织,其诱导率受基因型限制。就我国转基因玉米育种工作而言,大多数玉米骨干系胚性愈伤组织诱导率低,不能直接作为转基因受体材料,因而严重阻碍了我国转基因玉米育种的快速发展。miRNA是一类重要的内源性非编码RNA,它通过与靶mRNA序列部分或者完全匹配从而行使对基因的剪切、抑制翻译等,对其表达进行调控,广泛参与植物生长发育及逆境胁迫响应过程；玉米转基因育种的理论研究与无数实践均已经证明,玉米胚性愈伤组织诱导率受基因型限制。因此,本研究通过miRNA途径探讨玉米胚性愈伤组织发生率的遗传机理,以期培育更多胚性愈伤组织高诱导率的骨干亲本系,提高我国玉米基因工程育种的效率。本研究选用玉米胚性愈伤组织强诱导能力自交系18-599R为供试材料,利用solexa高通量测序技术与生物信息学分析方法,挖掘获得了大量18-599R未成熟胚经2,4-D诱导形成胚性愈伤组织过程相关的miRNA,结合荧光定量PCR和miRNA转基因过表达技术,对重要候选miRNA进行了表达检测及基因功能初步验证；并通过靶基因降解组高通量测序技术获得了胚性愈伤组织形成过程相关miRNA的靶基因信息。通过本研究,获得以下研究结果与结论：(1) solexa高通量测序共筛选获得了20个已知miRNA保守家族的78个差异表达miRNA。从对照(Control)到愈伤诱导过程的后3阶段(Stage Ⅰ、StageⅡ和StageⅢ),共有45个miRNA呈上调表达趋势,占差异表达miRNA的57.69%；下调表达的miRNA占29.49%,共计23个；另外有10个miRNA在愈伤诱导全过程中表达有上调也有下调,占12.82%。表明大多数：miRNA均以上调表达趋势参与了玉米胚性愈伤组织形成过程的调控。(2)本研究发现了13个miRNA与zma-miR167、zma-miR172、zma-miR319、 zma-miR393、zma-miR396、zma-miR397、zma-miR408和zma-miR528等8个已知的玉米miRNA家族成员序列保守性极高,经进一步生物信息学分析证实它们是这些miRNA家族的新成员。(3)通过高通量测序挖掘获得7个新miRNA,属于4个miRNA家族,分别命名为：zma-miR701、zma-miR702、zma-miR703和zma-miR704,它们在愈伤形成过程存在不同程度及类型的差异表达。这些新miRNA长度为21-22nt,位于其二级结构3’端茎部,并且均具有较低的折叠自由能和典型的二级结构。(4)通过聚类分析可将测序获得的已知家族差异表达的miRNA分为4类表达模式：下调模式、表达差异不显著模式、上调模式和显著上调模式。同样表明参与调控胚性愈伤组织形成过程的miRNA多数为上调表达模式。对这4类miRNA表达模式的进一步分析推测,Stage II(初级愈伤形成期)可能是胚性愈伤组织形成过程中重要的质变阶段,与玉米胚性愈伤组织的形成密切相关。(5)通过荧光定量PCR验证了测序结果中14个差异表达的miRNA,发现除zma-miR156a、zma-miR167a、zma-miR1671和zma-miR827等4个miRNA下调表达,其余10个均显著上调表达。另外,定量PCR验证结果同部分测序结果的相关系数达到0.94以上,证明本研究测序结果准确性较高。(6)通过降解组测序获得了213个靶基因,分别受22个已知miRNA保守家族介导剪切。这些靶基因可分为细胞组成、分子功能和生物过程三类,分别参与调节植物生长发育、转录调控、胁迫响应、激素信号传导、植物代谢途径等过程。其靶基因功能主要涉及SBP、TCP、GAMYB、ARF、F-box和GRAS等转录因子。(7)降解组结果经KO分析,发现与胚性愈伤组织形成过程密切相关的显著通路是激素信号转导途径。愈伤形成过程中共有14个靶基因在该通路中表达,分别受zma-miR160、zma-miR167、zma-miR393和zma-miR394等4个]miRNA负调控,从而调控激素信号的转导,影响内源激素合成,最终调控胚性愈伤组织的形成。(8)对转基因T1代阳性植株幼胚胚性愈伤组织诱导率的鉴定结果表明,过表达zma-miR159a和zma-miR393a的转基因植株诱导率显著或极显著低于野生型对照,证明这些miRNA确实参与调控胚性愈伤组织形成过程。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-13
第一部分 文献综述  13-36
  1 玉米愈伤组织  13-19
    1.1 玉米愈伤组织的分类  14-15
    1.2 玉米愈伤组织的形成  15-16
    1.3 愈伤形成过程中的脱分化作用  16-17
    1.4 植物激素对脱分化作用的影响  17-19
  2 植物miRNA  19-30
    2.1 植物miRNA简介  19-20
    2.2 植物miRNA的特点  20-21
    2.3 植物miRNA的生物合成  21-22
    2.4 植物miRNA的作用机制  22
    2.5 植物miRNA的调控功能  22-25
      2.5.1 miRNA调控植物生长发育  22-23
      2.5.2 miRNA调节植物激素信号通路  23-24
      2.5.3 植物miRNA的胁迫响应  24-25
    2.6 植物miRNA研究方法  25-30
      2.6.1 植物miRNA的获得  25
      2.6.2 植物miRNA的表达检测  25-30
  3 植物miRNA靶基因  30-32
    3.1 植物miRNA靶基因预测  30
    3.2 植物miRNA靶基因验证  30-31
    3.3 miRNA靶基因降解组测序  31-32
  4 miRNA与植物分生组织  32-34
  5 目的与意义  34-35
  6 技术路线  35-36
第二部分 材料与方法  36-49
  1 实验材料  36-39
    1.1 供试玉米材料  36
    1.2 转化载体及宿主菌  36-37
    1.3 主要试剂  37-39
      1.3.1 试剂盒  37
      1.3.2 酶及相关试剂  37-38
      1.3.3 培养基及重要试剂配方  38-39
  2 实验方法  39-49
    2.1 愈伤组织的诱导及取样  39
    2.2 总RNA的提取  39-40
    2.3 总RNA样品的混合  40
    2.4 高通量测序  40-43
      2.4.1 华大Solexa深度测序  41-42
      2.4.2 降解组测序  42-43
    2.5 候选miRNA的表达验证  43-45
      2.5.1 miRNA的逆转录  43-44
      2.5.2 miRNA的实时荧光定量检测  44-45
    2.6 转基因验证  45-49
      2.6.1 miRNA过表达载体质粒转化农杆菌  45
      2.6.2 农杆菌转化胚性愈伤组织  45-46
      2.6.3 农杆菌转化茎尖分生组织  46-47
      2.6.4 转基因植株的PCR检测  47-48
      2.6.5 目的基因功能初探  48-49
第三部分 结果与分析  49-80
  1 愈伤形成各阶段miRNA深度测序  49-59
    1.1 RNA样品检测结果  49
    1.2 高通量测序的小分子RNA序列信息  49-51
    1.3 基因表达的高通量测序结果  51-52
    1.4 新发现的玉米miRNA  52-55
    1.5 已知miRNA家族的新成员  55-56
    1.6 各miRNA家族表达差异分析  56-58
    1.7 miRNA表达模式分析  58-59
  2 愈伤形成各阶段miRNA表达量的定量验证  59-70
    2.1 内参基因及miRNA加尾产物扩增溶解曲线  60-61
    2.2 候选miRNA的相对表达量  61-69
    2.3 miRNA相对定量结果与测序结果间相关性分析  69-70
  3 愈伤形成过程靶基因的降解组测序  70-76
    3.1 差异表达的靶基因的基本信息  70-71
    3.2 基因显著富集通路分析  71-72
    3.3 愈伤形成过程的重要生物学路径  72-75
    3.4 激素信号通路分析  75-76
  4 转基因验证部分miRNA功能  76-80
    4.1 转基因阳性PCR检测  76-78
    4.2 部分转基因阳性植株愈伤诱导率鉴定  78-80
第四部分 讨论  80-91
  1 鉴定玉米愈伤形成过程miRNA表达模式的作用  80-82
    1.1 重要意义  80-81
    1.2 应用前景  81-82
  2 miRNA表达模式  82-83
  3 部分差异miRNA作用机制  83-85
    3.1 zma-miR156  83-84
    3.2 zma-miR167和zma-miR393  84
    3.3 zma-miR319  84-85
  4 miRNA调节激素信号转导途径在脱分化过程发挥作用  85-87
  5 miRNA转基因验证结果讨论  87-88
  6 展望  88-91
第五部分 结论  91-93
参考文献  93-103
附录1 已知miRNAs的高通量测序结果  103-106
附录2 已知miRNA家族新成员二级结构  106-108
附录3 降解组靶基因信息  108-113
附录4 植物激素信号转导  113-114
攻读学位期间发表论文及获得成果  114

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 玉米（玉蜀黍）
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