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以小鼠N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶为靶点miRNA的筛选和鉴定

作　者: 曲建华
导　师: 张嘉宁
学　校: 大连医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ miRNA 鉴定
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


N-乙酰氨基糖基转移酶(GnT)催化GlcNAc的转移,参与天冬酰胺连接型聚糖(N-聚糖)或丝氨酸/苏氨酸连接型聚糖(O-聚糖)的合成,在生物体内发挥重要功能。GnT至少分为GnTⅠ到GnTⅥ六类,其中GnTⅢ能够将UDP-GlcNAc中的GlcNAc以β1,4连接的方式转移到N-聚糖核心的β甘露糖上,催化生成平分型的GlcNAc,而平分型结构不能成为GnTⅡ、GnTⅣ、GnTⅤ等其它糖基转移酶的底物。GnTⅣ能够将UDP-GlcNAc中的GlcNAc以β1, 4连接的方式催化到N-糖链寡糖核结构的GlcNAcβ1, 2-Manα1, 3臂上,从而参与复杂型糖链三天线以及四天线分支的合成。肿瘤的发生常常伴随着糖蛋白糖链结构的改变,一些糖基转移酶的产物,如GnTⅤ的产物N-糖链β1,6分支结构与肿瘤转移潜能密切相关。microRNA是一类在转录后水平起调控作用的非编码的小RNA分子,其通过与靶基因mRNA的3’-非翻译区结合,在转录后水平上对基因的表达进行调节。miRNA可以影响mRNA的稳定性,也可以对mRNA进行降解。但是,目前有关以糖基转移酶为靶点miRNA筛选及其功能研究的报道很少。本研究以筛选N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶GnT为靶点的miRNA为目的,以高通量芯片miRNA表达谱分析和生物信息学分析结果为基础,构建含有小鼠Mgat3,Mgat4a,Mgat5的3’UTR片段的双荧光素酶报告基因重组质粒GnTⅢ/pGL3、GnTⅣ/pGL3、GnTⅤ/pGL3,将其与侯选miRNA共转染小鼠肝癌Hepa1-6细胞,通过检测荧光素酶活性的变化,筛选以GnTⅢ、GnTⅣ、GnTⅤ为靶点的miRNA,进一步通过定量PCR、流式细胞术分析等技术检证miRNA对GnT表达、N-聚糖分支结构的合成及细胞生物学行为的影响。结果表明:miR-23与双荧光素酶报告基因重组质粒GnTⅢ/pGL3共转染后,荧光素酶活性下降;miR-23转染使Hepa1-6细胞Mgat3基因表达水平下降,平分型的GlcNAc的表达水平降低。以上结果提示:miR-23可能是以N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ为靶点的miRNA。

全文目录


摘要  6-7Abstract  7-9前言  9-10第一部分 以 N-乙酰葡糖胺基转移酶为靶点 miRNA 的生物信息学分析 以及荧光素酶报告基因载体的构建  10-25  材料与方法  10-18  结果  18-23  讨论  23-25第二部分 以 N-乙酰葡糖胺基转移酶为靶点的 miRNA 的验证  25-31  材料与方法  25-27  结果  27-29  讨论  29-31第三部分 miR-23 转染对小鼠肝癌 Hepa-6 细胞 Mgat3 基因表达的影响  31-37  材料与方法  31-33  结果  33-35  讨论  35-37结论  37-38参考文献  38-39综述  39-47  参考文献  44-47致谢  47

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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