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miRNA-23a在C2C12细胞成肌分化过程中的调节作用研究

作　者: 王丽
导　师: 陈华群
学　校: 南京师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: miRNA 肌肉分化 C2C12细胞肌球蛋白重链
分类号: Q952.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

脊椎动物的肌肉分化受多种转录因子的复杂的网络调控,目前,研究发现很多基因,包括生长因子、调节蛋白、受体以及转录因子都参与了肌分化的调节。多条信号通路也可以正向或负向调节肌分化。近年的研究发现,microRNA (miRNA)对肌肉发育进行精细的调节,是调节肌肉分化发育的一个新层次。miRNA是一类小非编码RNA,大小约22nt,在转录后水平调节基因的表达。已经发现的miRNA主要调节肌肉分化发育的中间过程,例如1niR-133、miR-206和miR-214等。本文通过生物信息学分析,发现成体动物骨骼肌的重要结构和功能蛋白-三种快肌肌球蛋白重链(myosin heavy chain, Myh1, Myh2, Myh4) mRNA的3’-UTR存在一种miRNA-23a结合序列。我们据此进行了以下研究：一、首先构建了niRNA-23a的真核表达载体pIRES2-EGFP-miRNA-23a,在pGL-3-promoter萤光素酶基因的3’端插入此三种靶基因mRNA的3’-UTR的mRNA结合序列。二者共同转染HEK293细胞,结果发现,miRNA-23a可以显著抑制报告基因的表达,提示它们为miRNA-23a的靶基因。二、小鼠成肌细胞C2C12在体外可诱导终末分化为肌肉细胞。本文应用实时定量RT-PCR方法分析了C2C12细胞分化过程中niRNA-23a的表达量。结果发现,miRNA-23a在增殖的细胞中存在低水平表达,在诱导分化的第1天至第3天持续降低,第5天时miRNA-23a达到一个高水平,而在此过程中C2C12细胞被诱导肌分化成熟,肌球蛋白重链(Myosin heavy chain, MHC)的蛋白表达量增加,提示C2C12细胞中miRNA-23a可能通过调节MHC的表达参与了肌分化。三、应用miRNA-23a的类似物(mimic)和抑制剂(inhibitor),证实其对于C2C12细胞的肌性分化确实具有调节作用。miRNA-23a的mimic转染细胞,细胞中MHC的蛋白表达水平明显降低,而mRNA的转录水平不被抑制,肌性分化受到抑制。说明miRNA-23a作用于翻译水平,在转录水平没有作用。四、成肌细胞可正常增殖,在分化条件下从细胞周期退出,进入分化过程。BrdU是一种核苷类似物,在细胞周期的S期可参入DNA链。本文应用免疫荧光技术发现,在诱导分化的C2C12细胞中,mimic转染细胞BrdU的参入水平明显高于对照组,说明1niRNA-23a促进了细胞的增殖,与以上的抑制分化结果一致。五、已有的研究发现,在不同的细胞中,miRNA-23a通过调节不同的靶基因发挥不同的功能。我们通过生物信息学分析也发现,与肌肉分化相关的一些调节因子或功能蛋白如MEF-2C及MurF等也存在miRNA-23a的互补结合序列。本文对miRNA-23a可能的靶基因也进行了分析。结果发现,miRNA-23a mimic抑制了MEF-2C的表达,对于MurF则没有作用。萤光素酶报告基因结果表明,miRNA-23a对于MEF-2C的转录没有抑制作用。其可能通过其他途径调节MEF-2C的表达。综上所述,本文发现miRNA-23a通过调节MHC的翻译直接调节肌肉分化过程的肌终末分化,本文的研究结果为肌肉分化的调节提供了一个新的可能的机制。

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摘要 3-5Abstract 5-8第一章前言与综述 8-18 前言 8-10 第一节肌肉发育的研究进展 10-12 第二节 miRNA的研究进展 12-17 展望 17-18第二章实验研究部分 18-45 第一节 miRNA-23a表达载体以及Myh-1,Myh-2,Myh-4 mRNA 3'-UTR荧光素酶报告基因载体的构建 18-27 第二节荧光素酶活性分析实验 27-31 第三节 miRNA-23a对C2C12细胞分化的调节作用的研究 31-45参考文献 45-48第三章全文小结 48-49发表的论文 49-50致谢 50

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