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三聚氰胺ELISA快速检测试剂盒的研制

作　者: 岳慧慧
导　师: 苏国成
学　校: 集美大学
专　业: 微生物学
关键词: 三聚氰胺人工抗原多克隆抗体直接竞争酶联免疫法试剂盒
分类号: TS207.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

食品安全问题已引起全球的高度关注。在我国，三聚氰胺（MEL）已被列入生乳收购及乳制品产品出厂必检项目。三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化工中间体，因具价格低廉，广泛使用在建筑材料和油漆中，不法商人因其分子中氮含量较高，而违法添加到食品中，增加含氮量。三聚氰胺违法添加到奶制品中，严重损害了人们的健康。目前，酶联免疫检测法（ELISA）简便、快速，适合大规模样品筛选，但国内检测三聚氰胺的ELISA试剂盒主要依靠价格高昂的国外试剂盒，严重制约着ELISA法的推广。研制具有自主产权的快速检测三聚氰胺ELISA试剂盒，已成为监测MEL非法使用的当务之急。本研究在分析三聚氰胺分子结构和免疫原性的基础上，通过两种不同的方法：一是改造三聚氰胺结构类似物合成羧基化MEL半抗原，半抗原与载体蛋白偶联合成三聚氰胺人工抗原。二是由于三聚氰胺本身携带的氨基可直接与载体蛋白偶联合成三聚氰胺人工抗原。将合成用免疫原进行紫外和抗原抗体竞争结合鉴定，将偶联比高的免疫原免疫兔子，获得抗三聚氰胺血清，将抗三聚氰胺血清进行鉴定纯化后，用于直接ELISA并对其条件进行优化，从而建立直接ELISA快速检测三聚氰胺的方法，研制试剂盒并进行试剂盒验证，主要研究结果如下：1.免疫原采用多种化学方法进行合成。将原料2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪合成羧基化MEA，采用活性酯法和氯甲酸异丁酯法偶联羧基化MEA获得免疫原（MEA-BSA）和包被原（MEA-OVA）。利用三聚氰胺氨基采用戊二醛法直接与BSA合成人工抗原（MEL-BSA1和MEL-BSA₂）。经测定简单EDC法的半抗原与载体蛋白MEL-BSA偶联比为29.35:1。戊二醛法制备的三聚氰胺人工免疫原的偶联比为：MEL-BSA1为7.25:1；MEL-BSA₂为9.06:1；改造后合成的三聚氰胺人工免疫原的偶联比:MEA-BSA为29.63:1。2.用免疫原（MEA-BSA）免疫动物，第5次免疫后用间接ELISA法初步测定兔子抗血清效价为1:2000，抗血清IC₅₀值为45.92ng/mL。3.多克隆抗体纯化并经SDS-PAGE鉴定，紫外分光光度法测得纯化后的多克隆抗体浓度为8.76mg/mL。4.优化ELISA的反应过程中的一些参数，重新建立MEL标准曲线，方程Y=-46.77X+97.27，R²=0.997。经计算MEL的半数抑制率IC₅₀为10.24ng/mL。5.进行试剂盒组装及其对试剂盒的评估,并用高效液相对此试剂盒进行了验证。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-12
第1章绪论  12-20
  1.1 三聚氰胺的选题背景  12
  1.2 三聚氰胺的性质及应用  12-13
    1.2.1 物理性质  12
    1.2.2 化学性质  12-13
    1.2.3 三聚氰胺生产工艺及用途  13
    1.2.4 三聚氰胺伪蛋白原理  13
  1.3 三聚氰胺的毒理学性质  13-14
    1.3.1 食品中三聚氰胺的来源及其存在形式  13-14
    1.3.2 三聚氰胺的制毒机制  14
    1.3.3 三聚氰胺的代谢规律  14
  1.4 三聚氰胺的检测方法  14-17
    1.4.1 高效液相色谱法  15
    1.4.2 液相色谱-质谱联用法  15
    1.4.3 气相色谱-质谱联用法  15-16
    1.4.4 毛细管电泳法  16
    1.4.5 免疫化学检测法  16-17
  1.5 本课题研究内容与目标  17-20
    1.5.1 立题意义  17-18
    1.5.2 研究内容  18
    1.5.3 研究目标  18
    1.5.4 实验路线图  18-20
第2章三聚氰胺及其人工抗原的合成与鉴定  20-31
  2.1 实验材料  20-21
    2.1.1 主要试剂与仪器  20
    2.1.2 主要仪器  20-21
  2.2 实验方法  21-25
  2.3 实验结果与分析  25-28
  2.4 讨论  28-30
    2.4.1 半抗原的设计  28-29
    2.4.2 人工抗原的设计  29-30
  2.5 小结  30-31
第3章三聚氰胺多克隆抗体的制备及鉴定  31-39
  3.1 实验材料  31-32
    3.1.1 主要试剂与仪器  31
    3.1.2 主要溶液  31-32
  3.2 实验方法  32-35
    3.2.1 多克隆抗体的制备  32-33
    3.2.2 多克隆抗体的免疫学鉴定  33-35
  3.3 实验结果  35-38
    3.3.1 抗血清效价的测定  35-36
    3.3.2 抗血清灵敏度鉴定  36
    3.3.3 抗血清特异性鉴定  36-37
    3.3.4 多克隆抗体的纯化及其浓度鉴定  37-38
  3.4 讨论  38
    3.4.1 动物免疫的选择  38
    3.4.2 免疫血清的筛选  38
  3.5 小结  38-39
第4章三聚氰胺 ELISA 试剂盒的研制  39-48
  4.1 实验材料  39
  4.2 实验方法  39-43
    4.2.1 直接竞争酶联免疫检测方法的建立  39-41
    4.2.2 样品添加回收测定  41-42
    4.2.3 直接 ELISA 方法评价  42-43
  4.3 结果与分析  43-47
    4.3.1 酶标抗原浓度的优化  43
    4.3.2 抗体包被量的确定  43
    4.3.3 直接 ELISA 法甲醇浓度对抗原抗体结合的影响  43-44
    4.3.4 直接 ELISA 法标准曲线的建立  44
    4.3.5 直接 ELISA 法条件优化  44-46
    4.3.6 三聚氰胺 ELISA 方法建立及评价  46-47
  4.4 讨论  47-48
第5章高效液相色谱检测三聚氰胺  48-52
  5.1 实验材料  48
    5.1.1 主要试剂与仪器  48
    5.1.2 主要溶液  48
  5.2 液相样品处理  48-49
    5.2.1 样品的提取  48-49
    5.2.2 净化  49
  5.3 结果与讨论  49-52
    5.3.1 色谱柱的选择  49
    5.3.2 检测波长的选择  49
    5.3.3 柱温的选择  49
    5.3.4 流速的选择  49
    5.3.5 流动相的选择  49
    5.3.6 三聚氰胺的标准曲线  49-50
    5.3.7 三聚氰胺样品的加标和样品液相图  50-51
    5.3.8 直接竞争 ELISA 检测结果与仪器分析结果对比  51-52
第6章总结与展望  52-54
  6.1 总结  52
  6.2 展望  52-54
致谢  54-55
参考文献  55-60
在学期间发表的学术论文  60

三聚氰胺ELISA快速检测试剂盒的研制

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