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以甘油为底物构建肺炎克雷伯氏重组菌生产3-羟基丙酸

作　者: 王熙
导　师: 田平芳
学　校: 北京化工大学
专　业: 化学工程与技术
关键词: 3-羟基丙酸 肺炎克雷伯氏菌 醛脱氢酶 重组菌 发酵 质粒消除 DNA组装
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 84次
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内容摘要


3-羟基丙酸(3-HP)是一种重要的平台化合物,其生物合成方法与工业化程度引起了广泛的重视。本文选取具有高浓度甘油耐受力的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)作为3-HP的生产宿主,以K. pneumoniae的组成型启动子分别构建了醛脱氢酶基因ald4与甘油脱水酶基因dhaB的串联共表达质粒pKP-28a-AB,经SDS-PAGE分析,重组菌的关键酶基因得以有效表达。摇瓶批式发酵显示,重组菌K. pneumoniae(pKP-28a-AB)在有氧条件下,3-HP产量为0.336 g·L-1,甘油转化率为0.1(mol-mol-1 glycerol)。以关键酶共表达质粒pKP-28a-AB,分别转化1,3-丙二醇高产菌株K.pneumoniae K2与乳酸脱氢酶基因敲除菌株K. pneumoniae Kp5-3,获得的重组菌K2-AB与Kp5-3-AB经初步发酵分析显示,重组菌K2-AB在小试条件下的3-HP产量为3.09 g.L-1,甘油转化率为0.68 (mol-mol-1 glycerol),相比已构建的重组菌具有最高的3-HP生成量；重组菌Kp5-3-AB的摇瓶批式发酵结果显示,3-HP浓度相比对照菌株提高了～1倍,乳酸浓度降低了～1倍。建立了两种消除K. pneumoniae重组型质粒的方法：连续传代法与SDS法。其中,用0.2% SDS复合Ca2+处理K. pneumoniae,能有效消除其重组型质粒,获得的质粒消除菌可再次导入新的质粒。利用建立的质粒消除方法,初步研究了抗性胁迫条件对重组菌生产3-HP的影响,发酵分析显示,新构建的重组菌3-HP生成量相比同基因型的对照菌株提高了24.57%。利用合成生物学领域新兴的应用,设计了构建“细胞工厂”的五个通用研究步骤。将DNA组装技术引入实验,以Polymerase cycling assembly(PCA)的方法研究质粒构建的问题,并依靠两个线性DNA片段构建出-4.5kb的完整质粒,为实现快速有效的非连接酶克隆体系做出有益尝试。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-20
第一章 绪论  20-34
  1.1 3-羟基丙酸概况  20-23
    1.1.1 3-羟基丙酸理化性质与用途  20-22
    1.1.2 3-羟基丙酸的生产方法  22-23
  1.2 3-羟基丙酸的生物合成途径  23-26
    1.2.1 代谢途径设计  23-24
    1.2.2 以葡萄糖为底物  24-25
    1.2.3 以甘油为底物  25-26
  1.3 生产菌种  26-27
  1.4 生理工程简介  27-28
  1.5 合成生物学与DNA组装技术简介  28-33
    1.5.1 引言  28-29
    1.5.2 体内组装DNA策略  29-31
    1.5.3 体外组装DNA策略  31-33
  1.6 本课题的立项意义  33-34
第二章 酿酒酵母醛脱氢酶ald4基因的克隆  34-50
  2.1 引言  34
  2.2 实验材料  34-35
    2.2.1 菌株与质粒  34
    2.2.2 试剂与仪器  34-35
    2.2.3 培养基  35
  2.3 实验方法  35-44
    2.3.1 酿酒酵母S.cerevisiae基因组DNA的提取  35-36
    2.3.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因ald4  36-37
    2.3.3 琼脂糖凝胶电泳鉴定和分离目的基因ald4  37-38
    2.3.4 TA克隆构建质粒pMD 18-T-ald4  38-39
    2.3.5 质粒pMD 18-T-ald4转化大肠杆菌  39
    2.3.6 质粒pMD 18-T-ald4的鉴定  39-41
    2.3.7 质粒pKP-28a-ald4的构建  41-42
    2.3.8 质粒pKP-28a-ald4的鉴定  42-43
    2.3.9 重组质粒pKP-28a-ald4电击法转化K.pneumoniae  43-44
  2.4 结果与讨论  44-49
    2.4.1 S.cerevisiae基因组DNA的提取  44-45
    2.4.2 聚合酶链式反应扩增基因ald4  45-46
    2.4.3 T载体重组子的鉴定  46-47
    2.4.4 ald4基因的序列测定与分析  47
    2.4.5 重组表达载体pKP-28a-ald4的构建与鉴定  47-49
  2.5 本章小结  49-50
第三章 共表达醛脱氢酶与甘油脱水酶基因及产3-羟基丙酸研究  50-66
  3.1 引言  50
  3.2 实验材料  50-51
    3.2.1 菌株、质粒、引物  50-51
    3.2.2 试剂与仪器  51
    3.2.3 培养基  51
  3.3 实验方法  51-58
    3.3.1 质粒pKP-28a-dhaB的构建  51
    3.3.2 ald4与dhaB基因串联共表达质粒的构建  51-53
    3.3.3 质粒载体的去磷酸化  53
    3.3.4 PCR方法快速鉴定重组体DNA插入方向  53-54
    3.3.5 重组质粒pKP-28a-AB电击法转化K.pneumoniae  54
    3.3.6 醛脱氢酶基因ald4与甘油脱水酶基因dhaB在K.pneumoniae中的表达  54-57
    3.3.7 重组菌的发酵培养  57
    3.3.8 高效液相色谱(HPLC)检测3-羟基丙酸产物浓度  57
    3.3.9 改进的高碘酸钠氧化法测定发酵液中的甘油浓度  57-58
  3.4 结果与讨论  58-64
    3.4.1 质粒pKP-28a-dhaB的构建  58-59
    3.4.2 ald4-EcoR I-SD基因的克隆  59-60
    3.4.3 PCR方法快速鉴定重组体DNA插入方向  60
    3.4.4 串联共表达质粒pKP-28a-AB的鉴定  60-61
    3.4.5 重组菌共表达ald4与dhaB基因  61-62
    3.4.6 重组菌K.pneumoniae(pKP-28a-AB)以甘油为底物发酵生产3-羟基丙酸  62-64
  3.5 本章小结  64-66
第四章 重组菌K.pneumoniae生产3-羟基丙酸的研究  66-76
  4.1 引言  66
  4.2 实验材料  66-67
    4.2.1 菌株与质粒  66
    4.2.2 试剂与仪器  66-67
    4.2.3 培养基  67
  4.3 实验方法  67-69
    4.3.1 发酵条件与培养方法  67
    4.3.2 发酵参数测定与分析  67-69
  4.4 结果与讨论  69-74
    4.4.1 重组菌K.pneumoniae K2-AB的发酵特性  69-70
    4.4.2 重组菌K.pneumoniae K2-AB的放大培养研究  70-72
    4.4.3 重组菌K.pneumoniae Kp5-3-AB的产3-羟基丙酸研究  72-74
  4.5 本章小结  74-76
第五章 消除K.pneumoniae重组型质粒的方法与应用  76-86
  5.1 引言  76
  5.2 实验材料  76-78
    5.2.1 菌株与质粒  76-77
    5.2.2 试剂与仪器  77
    5.2.3 培养基  77-78
  5.3 实验方法  78-79
    5.3.1 连续传代法消除K.pneumoniae质粒  78
    5.3.2 SDS方法消除K.pneumoniae质粒  78
    5.3.3 质粒的再导入  78
    5.3.4 质粒消除在生理工程中的应用  78-79
    5.3.5 种子发酵培养  79
  5.4 结果与讨论  79-85
    5.4.1 连续传代培养对质粒消除的影响  79-80
    5.4.2 SDS方法消除重组质粒  80-81
    5.4.3 质粒消除菌重新导入新质粒  81-82
    5.4.4 质粒消除方法在生理工程中的应用  82-85
  5.5 本章小结  85-86
第六章 DNA快速组装技术的理论研究与应用  86-98
  6.1 引言  86
  6.2 实验材料  86-87
    6.2.1 菌株、质粒  86
    6.2.2 试剂与仪器  86-87
    6.2.3 培养基  87
  6.3 实验方法  87-90
    6.3.1 大肠杆菌E.coli基因组的提取  87-88
    6.3.2 大肠杆菌E.coli K-12 aldH基因的准备  88
    6.3.3 线性化质粒骨架的准备  88
    6.3.4 Polymerase cycling assembly(PCA)连接质粒骨架与插入基因  88-90
  6.4 结果与讨论  90-97
    6.4.1 利用DNA组装技术构建"细胞工厂"  90-93
      Ⅰ.修建结构架构(Building structural frameworks)  91-92
      Ⅱ.安装固定设备(Setting fixed parts)  92
      Ⅲ.铺设管线(Laying pipelines)  92
      Ⅳ.增添移动设施(Equipping mobile devices)  92
      Ⅴ.安装调控软件(Installing regulatory software)  92-93
    6.4.2 大肠杆菌E.coli K-12基因组DNA的提取  93-94
    6.4.3 大肠杆菌E.coli K-12 aldH基因的克隆  94-95
    6.4.4 质粒骨架pKP-28a-dhaB的线性化  95
    6.4.5 重组质粒pKP-28a-BH阳性克隆子的鉴定  95-97
  6.5 本章小结  97-98
第七章 实验总结与建议  98-100
  7.1 主要结论  98-99
  7.2 问题与建议  99-100
参考文献  100-104
附录1 试剂  104-106
附录2 仪器设备  106-107
致谢  107-108
北京化工大学硕士研究生学位论文答辩委员会决议书  108-109

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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