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海洋普鲁兰短梗霉HN6.2菌株铁载体合成与调控的研究

作　者: 池哲
导　师: 汝少国
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 海洋普鲁兰短梗霉铁载体的合成与调控 L-鸟氨酸-N~5-羟化酶SidA基因 GATA类型转录抑制因子SRE1基因基因敲除解阻遏
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

普鲁兰短梗霉(Aureobasidium pullulans)HN6.2菌株由海洋环境中分离获得,为一株可高产异羟肟酸类铁载体Fusigen的海洋酵母。在最优条件下,其铁载体产量最高可达到0.44mM,在培养基中添加Fe3+后该菌株铁载体的产量明显减少,该菌株所产铁载体对海洋鳗弧菌和海洋副溶血弧菌具有明显的抑菌活性。但是目前其他实验室还未在分子水平上对该菌株铁载体合成与调控机制进行研究。Fusigen铁载体的合成途径起始于L-鸟氨酸-N5-羟基化,由L-鸟氨酸-N5-单加氧酶催化,形成N5-羟基L-鸟氨酸,即铁载体的基本结构单元。数个该结构基本单元在非核糖体肽合成酶(NRPSs)的催化下组装为铁载体,所以L-鸟氨酸-N5-单加氧酶催化该铁载体合成反应的第一步反应。为了研究该酵母菌铁载体合成和调控的功能基因,本研究构建了该菌株的基因敲除元件。该元件由TEF启动子,潮霉素B磷酸转移酶基因(HPT基因)和特定终止子序列(polyA)构成,将该元件命名为pGDMIAP-1。在该元件的两端连接上来自该菌株的蛋白酶基因5’-端同源重组片段(Y-arm)和3’-端同源重组片段(3’-anm)后得到碱性蛋白酶基因敲除载体,该敲除载体转化到HN6.2菌株细胞后,获得的敲除菌株碱性蛋白酶活性大幅下降,说明基因敲除元件pGDMIAP-1在HN6.2菌株中可以正常起作用,敲除载体构建成功。在本研究中,通过反向PCR和RT-PCR的方法克隆了催化HN6.2菌株铁载体合成途径第一步反应的L-鸟氨酸-N5-单加氧酶(L-鸟氨酸-N5-羟化酶)基因,将该基因命名为SidA,该基因GenBank登录号为FJ769160。该基因ORF长度为1461bp,无内含子,编码486个氨基酸,推导的蛋白质等电点为7.79,分子量为55421。该基因上游启动子包含一个CAAT盒和两个转录抑制因子结合位点GATA盒。利用上述构建的A. pullulans HN6.2菌株基因敲除元件pGDMIAP-1将HPT基因插入到sidA基因的ORF中,实现了该基因的敲除。获得的敲除菌株S6由于铁载体合成受阻在缺铁培养基中几乎不能生长,但在含有10μMFe3+和Fe2+的富铁培养基中可以正常生长；胞内胞外铁载体含量均为0；失去对海洋鳗弧菌和海洋副溶血弧菌的抑制作用；敲除菌株胞内铁载体的缺失导致其在缺铁培养基中停止出芽,同时对过氧化氢敏感性较原始菌株明显提高。因此,我们推断A. pullulans HN6.2所产的铁载体在铁的螯合、吸收和浓缩中发挥了重要的作用,以维持细胞的正常生理功能。同时,在微生物中与铁载体合成的相关基因受到严格且精细的控制,其中一种铁载体生物合成正调控机制是通过转录激活发挥作用,而另外一种是铁载体合成的负调控机制,通过高度保守的GATA类型的转录抑制因子发挥作用。GATA类型的转录抑制因子一般含有两个锌指结构域,可以与铁载体合成有关基因的启动子结合,从而抑制这些基因的表达。为了了解铁离子对HN6.2菌株铁载体合成的抑制作用机理,有必要克隆这种酵母菌的GATA类型的转录抑制因子基因。所以本研究使用反向PCR和RACE的方法克隆了该菌株中调控铁载体合成的GATA类型转录抑制因子基因SRE1,该基因GenBank登录号为JM086999。该基因包含一段51bp的内含子,ORF长度为1002bp,编码334个氨基酸,推导的蛋白质等电点8.58,分子量35067,氨基酸序列中含有两个保守的锌指结构域[Cys-(X2)-Cys-(X17)-Cys-(X2)-Cys)],9个调控基因特征序列Ser(Thr)-Pro-X-X,在两个锌指结构域之间含有一个富含半胱氨酸、能与铁结合的中心结构域。利用上述pGDMIAP-1构建的敲除载体将该基因敲除后,获得了转化菌株R6。在铁离子存在的情况下转化菌株R6依然可以合成胞内及胞外铁载体,L-鸟氨酸-N5-羟化酶基因SidA的表达量受到部分抑制,而野生型酵母中的L-鸟氨酸-N5-羟化酶基因SidA的表达受到完全抑制,说明转化菌株实现了部分的铁离子解阻遏作用。转化菌株在富铁培养基中可以生长,并且菌落呈现棕色,说明它们为富铁细胞,具有潜在的应用,而在1.5mMFe3+和2.0mM Fe3+的高浓度铁离子培养基中原始菌株无法生长。由于转化菌株R6在富铁培养基中仍然可以产生大量的铁载体,所以在该种培养基中获得的转化菌株R6培养上清液仍有明显的抑菌活性。这是首次对海洋酵母菌铁载体合成与调控进行了比较全面系统的研究。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
目录  9-11
第一章绪论  11-26
  1 前言  11-12
  2 铁获取的机制  12-13
  3 铁载体的分类  13-15
  4 真菌铁载体的生物合成和有关的基因  15-18
  5 真菌铁载体合成和运输的调控  18-20
  6 胞内和胞外铁载体的作用  20-22
  7 基因敲除  22-23
  8 普鲁兰短梗霉的简介  23-24
  9 本论文的研究内容和研究目的与意义  24-26
第二章普鲁兰短梗霉HN6.2菌株基因敲除元件的构建  26-38
  1 前言  26-27
  2 材料与方法  27-34
  3 结果与讨论  34-37
    3.1 A.pullulans HN6.2菌株基因组DNA的提取  34
    3.2 A.pullulans HN6.2菌株基因敲除元件的构建  34-37
  4 本章小结  37-38
第三章普鲁兰短梗霉HN6.2基因敲除元件功能的初步验证  38-51
  1 前言  38-39
  2 材料与方法  39-46
  3 结果与讨论  46-50
    3.1 A.pullulans HN6.2菌株ALP1基因的克隆  46-47
    3.2 ALP1基因敲除载体的构建  47-48
    3.3 A.pullulans HN6.2菌株的转化与转化菌株的筛选  48-49
    3.4 ALP1基因敲除的验证  49
    3.5 胞外碱性蛋白酶酶活力的测定  49-50
  4 本章小结  50-51
第四章普鲁兰短梗霉HN6.2菌株L-鸟氨酸-N~5-羟基化酶基因SidA的克隆  51-74
  1 前言  51-53
  2 材料与方法  53-59
  3 结果与讨论  59-73
    3.1 限制性内切酶酶切A.pullulans HN6.2菌株基因组DNA  59
    3.2 反向PCR结果  59-60
    3.3 拼接结果的比对  60-61
    3.4 ORF的预测  61-62
    3.5 RT-PCR  62-65
    3.6 SidA基因的生物信息学分析  65-73
  4 本章小结  73-74
第五章普鲁兰短梗霉HN6.2菌株L-鸟氨酸-N5-羟基化酶基因SidA的敲除  74-90
  1 前言  74-75
  2 材料与方法  75-80
  3 结果与讨论  80-88
    3.1 SidA基因的敲除  80-83
    3.2 不同浓度的亚铁离子和铁离子对敲除菌株S6和原始菌株HN6.2细胞生长的影响  83-86
    3.3 △SidA菌株与原始菌株的细胞出芽情况  86
    3.4 △SidA菌株与原始菌株的抑菌活性  86-87
    3.5 △SidA菌株与原始菌株对过氧化氢的敏感性  87-88
  4 本章小结  88-90
第六章普鲁兰短梗霉HN6.2菌株GATA类型转录抑制子基因SRE1的克隆和该基因的敲除  90-108
  1 前言  90-91
  2 材料与方法  91-96
  3 结果与讨论  96-106
    3.1 普鲁兰短梗霉SRE1基因的克隆及特征分析  96-100
    3.2 SRE1基因的敲除  100
    3.3 铁载体的合成及L-鸟氨酸-N~5-单加氧酶基因的表达  100-103
    3.4 不同浓度Fe~(2+)和Fe~(3+)对转化子R6及HN6.2菌株细胞生长的影响  103-105
    3.5 抑菌活性  105-106
  4 本章小结  106-108
论文总结与创新点  108-110
  1 论文总结  108-109
  2 本论文的创新点  109-110
参考文献  110-117
附录  117-118
个人简历及已发表的学术论文  118-120
致谢  120

海洋普鲁兰短梗霉HN6.2菌株铁载体合成与调控的研究

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