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福氏志贺菌2a型301株uhpT突变体的构建及功能分析

作　者: 郭静一
导　师: 宾文
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 基因敲除 uhpT 福氏志贺菌2a型301株
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 11次
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内容摘要

本文以基因敲除方法研究志贺氏菌的功能基因,以RecA重组系统为基础,采用低拷贝自杀质粒pCVD442作为本敲除体系的重组载体,为了克服该质粒在进行分子克隆操作中的困难,将Gateway技术应用在敲除前期的重组质粒构建过程中,成功构建了福氏志贺菌2a型301株uhpT基因部分缺失的突变体MT,从而建立了在福氏志贺菌中进行定位插入或缺失突变的敲除技术平台。对突变株分别在培养基、细胞水平进行了功能检测。在普通LB培养基及TSB培养基中突变株与野生株的生长没有显著差异；突变株在U937细胞的胞内存活增殖能力与野生株没有显著差异,在HeLa细胞的胞内存活增殖能力突变株比野生株下降了12.7%。这说明uhpT基因在志贺氏菌的胞内存活增殖中仍然具有一定的作用。上述结果提示志贺氏菌中uhpT基因与细菌在细胞内的存活和增殖有关,可能由于细菌中其它碳源物质转移酶系统的存在代偿了敲除基因的功能缺陷,因此突变体在生长水平没有特别显著的变化。利用Gateway技术与自杀质粒相结合的敲除体系具有高效高通量的特点。本研究建立了一种对福氏志贺菌功能基因组研究有效的基因敲除技术平台,并且提供了对志贺氏菌中未知功能基因研究值得参考的新思路。

全文目录

中文摘要  10-11
英文摘要  11-12
第一章引言  12-16
  1.1 志贺氏菌属(Shigella)的研究背景  12-14
  1.2 基因功能的研究方法与基因敲除技术  14-15
  1.3 基因uhpT的研究进展  15-16
第二章材料和方法  16-30
  2.1 实验材料  16-20
  2.2 实验方法  20-30
第三章福氏志贺菌2a型301株uhpT突变体的构建  30-43
  3.1 福氏志贺菌的检测  30-31
  3.2 重组同源臂的选取  31-34
  3.3 目的片段扩增  34-36
  3.4 目的片段与PENTR/D-TOPO连接  36-37
  3.5 卡那霉素抗性基因aphA-3片段的扩增  37-38
  3.6 Entry载体的构建  38-39
  3.7 Destination载体的构建  39
  3.8 同源重组质粒的构建  39-40
  3.9 同源重组过程  40-42
  3.10 突变株的获得和验证  42-43
第四章突变株性状与功能检测  43-46
  4.1 体外培养突变株和野生株生长情况  43-44
  4.2 细胞感染实验  44-46
第五章结论  46-47
  5.1 福氏志贺菌2a型301株uhpT基因部分缺失突变体MT的构建  46
  5.2 uhpT基因部分缺失突变体功能检测  46-47
第六章讨论  47-55
  6.1 志贺氏菌在宿主细胞内增殖存活条件及基因uhpT的作用  47-49
  6.2 基因敲除策略及实验材料选择  49-55
参考文献  55-57
致谢  57

福氏志贺菌2a型301株uhpT突变体的构建及功能分析

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