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稻瘟病菌亚甲基四氢叶酸还原酶基因（MoMET13）功能的初步研究

作　者: 王红
导　师: 王政逸
学　校: 浙江大学
专　业: 植物病理学
关键词: 稻瘟病菌 T-DNA插入突变 致病缺陷突变体 MoMET13 MoMET12 基因敲除 基因互补 甲硫氨酸
分类号: S435.111
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本文利用农杆菌介导的ATMT转化技术成功获得一个稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）致病缺陷突变体Wh-672,并鉴定了T-DNA标记的基因MoMET13,进而通过敲除和互补验证对MoMET13的生物学功能做了初步分析。利用农杆菌介导转化法（ATMT）筛选出一个对大麦和水稻都完全失去致病性的稻瘟病菌突变体Wh-672。Wh-672在CM培养基上菌落生长速率明显减慢,菌落白色,无气生菌丝,不产生分生孢子。采用hiTAIL-PCR的方法扩增了T-DNA右边界的610bp基因组DNA序列,并克隆到pGEM-Teasy载体上。测序和BLAST分析结果显示,T-DNA标记基因编号为MGG01728.6,该基因位于第1染色体的Supercontig 27内,由1948个碱基组成,编码627个氨基酸,内有2个外显子和1个内含子,T-DNA插入位点在MoMET13基因起始密码上游815bp处。MGG 01728与Sc MET13和Sp MET9的同源性分别为46.9%,48.03%,这些序列属于亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR）超家族成员。通过构建MoMET13基因敲除载体和稻瘟病菌原生质体转化得到96个转化子,并通过PCR和Southern杂交筛选出4个MoMET13基因敲除转化子。突变体表型分析结果表明,△Momet13突变体不能在缺甲硫氨酸的基本培养基上生长,对寄主的致病性丧失,其它表型也与Wh-672突变体完全一致。为了进一步验证突变体Wh-672的表型改变是由T-DNA插入引起的,构建了融合MoMETl3和绿色荧光蛋白基因GFP的互补载体,分别对Wh-672和△Momet13突变体进行了互补转化,获得58个互补转化子。选取转化子672-hb3进行表型互补分析,结果显示突变体的所有表型均得到恢复。通过激光扫描共聚焦显微镜在672-hb3的菌丝、孢子和附着胞内几乎都观察不到GFP绿色荧光,说明MoMET13基因在营养生长、产孢和附着胞形成过程中低水平表达。生物信息学分析表明,在稻瘟病菌中除MoMET13外,MoMET12也可编码亚甲基四氢叶酸还原酶,它们分别与酿酒酵母（S. cerevisiae）的MET13和MET12同源。为进一步了解稻瘟病菌MoMET12基因的功能,通过构建MoMET12基因敲除载体和原生质体转化得到269个转化子,用PCR的方法筛选出4个敲除转化子,△Momet12突变体与△Momet13突变体类似也不能在缺甲硫氨酸的基本培养基上正常生长,但△Momet12突变体的其它表型（如产孢、致病性等）与野生菌株Guy11基本一致。综合上述,亚甲基四氢叶酸还原酶基因（MoMET3）在稻瘟病菌致病过程中起关键作用。

全文目录


致谢  8-9
目录  9-12
摘要  12-14
Abstract  14-16
第一章 文献综述  16-30
  1. 稻瘟病概述  16-18
    1.1 稻瘟病及病原菌  16
    1.2 稻瘟病的发病规律  16-17
    1.3 稻瘟病菌的侵染过程  17-18
  2. 稻瘟菌致病相关基因的研究进展  18-23
    2.1 产孢相关基因  18-19
    2.2 附着孢发育相关基因  19-23
      2.2.1 界面硬度和疏水性影响附着胞的分化  19
      2.2.2 分生孢子分泌疏水蛋白识别胞外信号  19-20
      2.2.3 细胞质膜跨膜蛋白和胞外信号传递  20-21
      2.2.4 附着胞黑色素层的沉积与膨压的形成  21-22
      2.2.5 分生孢子特异性内含物与膨压的形成  22-23
  3. 农杆菌介导的稻瘟病菌T-DNA转化和插入突变研究  23-25
    3.1 丝状真菌遗传转化的研究进展  23-24
    3.2 农杆菌介导的T-DNA转化研究  24-25
    3.3 T-DNA插入突变的优势分析  25
  4. 扩增侧翼序列技术TAIL-PCR(THERMAL ASMMETRIC INTERLACED PCR)  25-26
  5. MTHFR的研究进展  26-28
    5.1 叶酸与methionine循环  26-27
    5.2 一碳单位代谢中MTHFR调节作用  27-28
  6. 本研究的目的意义和技术路线  28-30
第二章 材料与方法  30-45
  1. 材料  30-34
    1.1 实验菌株、质粒载体及水稻、大麦致病性测定品种  30-31
      1.1.1 实验菌株  30
      1.1.2 质粒载体  30-31
      1.1.3 水稻、大麦致病性测定品种  31
    1.2 各类抗生素、培养基及工具酶  31-34
      1.2.1 各类抗生素  31-32
      1.2.2 培养基  32-34
      1.2.3 工具酶  34
    1.3 各类生化试剂、溶液及试剂盒  34
  2 稻瘟病菌生物学性状测定试验  34-37
    2.1 菌落生长速度及菌落特性  35
    2.2 稻瘟病菌产孢培养和产孢量  35
    2.3 附着胞形成实验  35-36
    2.4 稻瘟菌有性生殖实验  36
    2.5 大麦和水稻离体接种  36
    2.6 稻瘟病菌菌丝、分生孢子和附着孢的GFP观察  36-37
  3 PCR扩增  37-38
    3.1 常规PCR反应体系  37
    3.2 细菌菌落PCR反应体系  37
    3.3 高效TAIL-PCR(hiTAIL-PCR)反应体系及反应程序  37-38
  4. 质粒DNA、基因组DNA及小片段DNA相关操作  38-41
    4.1 质粒DNA提取(CTAB法)  38-39
    4.2 基因组DNA抽提  39-40
    4.3 DNA酶切  40
    4.4 胶回收(Axyprep DNA gel extraction kit回收法)  40
    4.5 酶切DNA片段的去磷酸化  40-41
    4.6 连接反应  41
  5. 细菌和真菌转化  41-45
    5.1 农杆菌介导的T-DNA转化  41-42
    5.2 大肠杆菌感受态细胞制备及细菌转化  42-43
    5.3 稻瘟菌原生质体制备与转化  43-44
    5.4 酵母转化  44-45
第三章 结果与分析  45-67
  1. 致病缺陷突变体Wh-672的获得  45-47
    1.1 农杆菌介导的稻瘟菌T-DNA转化  45
    1.2 转化子致病性筛选和突变体Wh-672的获得  45-46
    1.3 突变体Wh-672遗传稳定性检测  46-47
  2. MoMET13基因的分离与同源性分析  47-52
    2.1 MoMET13基因的分离  47-48
    2.2 MoMET13基因的克隆、测序  48
    2.3 MoMET13基因的获得与序列分析  48-51
    2.4 MoMET13的同源基因  51-52
  3 MoMET13基因缺失突变  52-55
    3.1 MoMET13基因缺失载体构建  52-53
    3.2 MoMET13基因缺失突变体的获得及验证  53-55
  4 MoMET12基因缺失突变体  55-57
    4.1 MoMET12基因缺失载体构建  55-56
    4.2 MoMET12基因缺失突变体的获得及验证  56-57
  5. 突变体Wh-672性状恢复实验  57-58
    5.1 互补载体的构建  57-58
    5.2 互补转化  58
  6. 酵母互补  58-59
    6.1 酵母互补载体的构建  58-59
    6.2 酵母互补转化  59
  7 突变体生物学性状研究  59-67
    7.1 菌落形态和生长速度分析  59-60
    7.2 突变体在MM培养基生长状况  60-62
    7.3 分生孢子和附着孢形成观察  62-64
    7.4 有性生殖实验  64-65
    7.5 致病性分析  65-66
    7.6 荧光实时定量PCR  66-67
第四章 全文总结讨论及后续研究  67-70
  1. 全文总结讨论  67-68
  2. 存在的问题和今后的研究  68-70
参考文献  70-74
附表  74

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害
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