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玉米大斑病菌StPKS基因与黑色素合成及致病性的关系研究

作　者: 张鑫
导　师: 董金皋
学　校: 河北农业大学
专　业: 植物学
关键词: 玉米大斑病菌 聚酮体合成酶基因 RNA干扰 基因敲除 功能分析
分类号: S435.131
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本试验前期克隆获得了1个玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因(StPKS),为了明确该基因在玉米大斑病菌DHN黑色素合成以及病菌致病性中的作用,本研究利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)和基因敲除(Gene knock-out)两种方法分别创制StPKS基因沉默转化子和基因缺失突变体,通过对突变体进行分析,明确了该基因的功能,主要研究结果如下:以pSilent-1质粒和pBU质粒为载体,分别构建了StPKS基因的RNAi和同源重组载体,采用聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化方法,经潮霉素筛选、PCR及RT-PCR鉴定得到了5株StPKS基因表达量下降的RNAi转化子和1株基因缺失突变体。与野生型相比,5株RNAi转化子的菌丝形态很不规则,出现膨大、分枝、变形等表型变化,菌落颜色均趋向于白色,黑色素含量明显低于野生型;基因缺失突变菌株ΔStPKS不产生分生孢子,菌丝细胞壁透明,分隔不明显,细胞内部可见许多液泡状结构,菌落颜色为白色,黑色素含量明显降低,与RNAi转化子的表型相似,表明StPKS基因的编码产物与玉米大斑病菌DHN黑色素的生物合成、菌丝发育及分生孢子形成密切相关。对基因缺失突变菌株ΔStPKS的致病相关因子进行分析发现,野生型菌株及StPKS基因缺失突变体的附着胞膨压分别为5.4 MPa、4.6 MPa,ΔStPKS的附着胞形成时间推迟,产生及穿透玻璃纸的附着胞数量明显减少,该结果表明黑色素缺失突变体的附着胞形成受抑制,膨压有所下降,并且影响了病原真菌的穿透能力;另外,研究结果还发现,StPKS基因缺失并不影响玉米大斑病菌毒素活性,但可降低纤维素酶活性,即黑色素缺失突变菌株的侵染能力可能会大大下降。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
1 引言  9-12
  1.1 玉米大斑病及其致病菌  9
  1.2 黑色素的形成及作用  9-10
  1.3 PEG 介导的原生质体转化方法  10-11
  1.4 真菌聚酮体合成酶基因的研究进展  11-12
2 材料和方法  12-29
  2.1 试验材料  12-14
    2.1.1 菌株与质粒  12
    2.1.2 试剂  12-14
    2.1.3 培养基  14
    2.1.4 仪器设备  14
  2.2 StPKS 基因沉默转化子的创制及分析  14-21
    2.2.1 玉米大斑病菌StPKS 基因RNAi 载体的构建  14-19
    2.2.2 玉米大斑病菌StPKS 基因RNAi 转化子的获得  19
    2.2.3 玉米大斑病菌StPKS 基因RNAi 转化子的分析  19-21
  2.3 StPKS 基因缺失突变菌株的创制及分析  21-29
    2.3.1 玉米大斑病菌StPKS 基因敲除载体的构建  21-22
    2.3.2 玉米大斑病菌StPKS 基因敲除突变体的获得  22-23
    2.3.3 玉米大斑病菌StPKS 基因敲除突变体的分析  23-29
3 结果与分析  29-43
  3.1 StPKS 基因RNAi 载体构建及转化子分析  29-33
    3.1.1 RNAi 载体的构建  29-30
    3.1.2 RNAi 阳性转化子的获得  30
    3.1.3 RNAi 转化子的PCR 验证  30-31
    3.1.4 RNAi 转化子的StPKS 基因表达量分析  31
    3.1.5 RNAi 转化子的形态学特征观察  31-32
    3.1.6 RNAi 转化子菌丝的显微观察  32
    3.1.7 RNAi 转化子的黑色素含量测定  32-33
  3.2 StPKS 基因同源重组载体构建及突变体分析  33-43
    3.2.1 StPKS 基因敲除载体的构建  33-34
    3.2.2 StPKS 基因敲除突变体的获得  34-36
    3.2.3 突变菌株的RT-PCR 分析  36-37
    3.2.4 突变菌株的形态学观察  37
    3.2.5 突变菌株菌丝的显微观察  37
    3.2.6 突变菌株黑色素含量测定  37-38
    3.2.7 突变菌株附着胞产生量测定  38
    3.2.8 突变菌株附着胞膨压测定  38-39
    3.2.9 突变菌株附着胞穿透能力观察  39-40
    3.2.10 突变菌株侵染力观察  40-41
    3.2.11 突变菌株附着胞穿透率观察  41
    3.2.12 突变菌株胞壁降解酶活性测定  41-42
    3.2.13 突变菌株HT-毒素活性测定  42
    3.2.14 突变菌株HPLC 分析  42-43
4 讨论  43-46
  4.1 StPKS 基因与黑色素、毒素合成的关系  43-44
  4.2 DHN 黑色素与病原菌致病性的关系  44-45
  4.3 RNAi 与基因敲除技术的应用  45-46
5 结论  46-47
参考文献  47-52
在读期间发表的学术论文  52-53
作者简历  53-54
致谢  54-55

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