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稻瘟病菌假定几丁质酶基因功能分析

作　者: 林成增
导　师: 周洁
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 稻瘟病菌 几丁质酶 基因敲除 致病性
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 34次
引　用: 1次
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内容摘要


几丁质酶是降解几丁质糖苷键的水解酶。真菌中几丁质酶可能与细胞壁降解、孢子萌发、顶端生长、菌丝的分枝生长、孢子的脱离以及菌丝自溶有关。在研究表明稻瘟病菌一个假定的几丁质酶基因MGG08054.6基因敲除突变体的致病性降低的基础上,进一步研究了该家族的另外3个基因的功能。首先,通过生物信息学的方法,分析稻瘟菌糖苷水解酶18家族蛋白功能域、性质以及系统发育关系。并通过real-time PCR分析稻瘟菌糖苷水解酶18家族基因的表达情况。其次,通过对MGG00086.6、MGG07927.6和MGG01247.6进行基因敲除研究这些基因的功能。三个基因分别敲除后,与野生型相比其突变体菌落生长无明显差异,分生孢子生长发育不受影响,分生孢子隔膜无变化;洋葱表皮侵染实验结果表明,基因敲除突变体能够产生正常的侵入栓侵入洋葱表皮,并在在洋葱细胞内扩展生长;将敲除突变体接种水稻CO39,及在大麦叶片进行离体接种,观察其发病情况,结果表明突变体发病情况与野生型没有差别。说明这三个几丁质酶基因分别敲除后稻瘟病菌的形态建成和致病性并未受到影响。稻瘟病菌中几丁质酶形成一个多基因家族,多基因家族往往存在基因冗余效应,其机制有待进一步研究。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-10
1 引言  10-19
  1.1 稻瘟病菌侵染致病研究  10-12
    1.1.1 稻瘟病菌的侵染过程  10
    1.1.2 稻瘟病菌致病相关的信号途径  10-11
    1.1.3 稻瘟病菌产孢及附着胞形成相关基因研究  11-12
  1.2 几丁质酶及其功能研究  12-17
    1.2.1 几丁质及几丁质酶  12
    1.2.2 几丁质酶分类  12-13
    1.2.3 真菌几丁质酶的结构与特性  13-15
    1.2.4 真菌中几丁质酶功能研究  15-17
      1.2.4.1 酵母几丁质酶的功能研究  15-16
      1.2.4.2 丝状真菌几丁质酶的功能研究  16-17
  1.3 本研究的主要意义  17-19
2 材料与方法  19-31
  2.1 实验材料  19-20
    2.1.1 菌株  19
    2.1.2 质粒载体  19
    2.1.3 供试植物  19
    2.1.4 生化试剂  19
    2.1.5 培养基  19-20
  2.2 研究方法  20-31
    2.2.1 稻瘟菌糖苷水解酶18 家族蛋白序列获得及功能域分析  20
    2.2.2 稻瘟菌糖苷水解酶18 家族蛋白性质分析  20
    2.2.3 蛋白序列系统演化关系分析  20
    2.2.4 稻瘟病菌菌丝体、孢子、芽管以及附着胞获得  20-21
    2.2.5 总RNA 的提取与分析  21-22
    2.2.6 RT-PCR  22
    2.2.7 Real-Time PCR  22-24
    2.2.8 稻瘟病菌基因组DNA 的提取  24
    2.2.9 DNA 琼脂糖电泳  24
    2.2.10 PCR 反应  24-25
    2.2.11 基因敲除突变体载体的构建  25-26
    2.2.12 PCR 产物的克隆  26-27
    2.2.13 E.coli DH5α感受态细胞的制备  27
    2.2.14 感受态细胞的转化  27-28
    2.2.15 质粒 DNA 的提取  28
    2.2.16 质粒酶切与连接  28-29
    2.2.17 稻瘟病菌原生质体制备和转化  29
    2.2.18 稻瘟病菌菌落生长速度测定  29
    2.2.19 细胞形态观察  29-30
    2.2.20 细胞壁敏感性分析  30
    2.2.21 洋葱表皮内侵染结构的观察  30
    2.2.22 大麦接种试验  30
    2.2.23 水稻致病性鉴定  30-31
3 结果与分析  31-57
  3.1 稻瘟菌糖苷水解酶18 家族蛋白序列获得及功能域分析  31-32
  3.2 稻瘟菌糖苷水解酶18 家族蛋白性质分析  32-33
  3.3 稻瘟菌糖苷水解酶18 家族蛋白系统发育关系分析  33-35
  3.4 稻瘟病菌糖苷水解酶18 家族蛋白基因的表达分析  35-39
  3.5 MGG_07929.6 的功能分析  39-46
    3.5.1 MGG_07929.6 敲除突变体的获得  39-40
    3.5.2 MGG_07927.6 基因敲除突变体菌落生长速率测定  40-41
    3.5.3 MGG_07927.6 基因敲除突变体细胞形态观察  41-43
    3.5.4 MGG_07927.6 基因敲除突变体细胞壁敏感性分析  43-44
    3.5.5 MGG_07927.6 基因敲除突变体侵染洋葱表皮分析  44-45
    3.5.6 MGG_07927.6 基因敲除突变体致病性分析  45-46
  3.6 MGG_01247.6 的功能分析  46-53
    3.6.1 MGG_01247.6 敲除突变体的获得  46-47
    3.6.2 MGG_01247.6 基因敲除突变体菌落生长速率测定  47-48
    3.6.3 MGG_01247.6 基因敲除突变体细胞形态观察  48-49
    3.6.4 MGG_01247.6 基因敲除突变体细胞壁敏感性分析  49-51
    3.6.5 MGG_01247.6 基因敲除突变体侵染洋葱表皮分析  51-52
    3.6.6 MGG_01247.6 基因敲除突变体致病性分析  52-53
  3.7 MGG_00086.6 的功能分析  53-57
    3.7.1 MGG_00086.6 敲除突变体的获得  53-54
    3.7.2 MGG_00086.6 基因敲除突变体细胞形态观察  54-55
    3.7.3 MGG_00086.6 基因敲除突变体侵染洋葱表皮分析  55-56
    3.7.4 MGG_00086.6 基因敲除突变体致病性分析  56-57
4 小结和讨论  57-59
参考文献  59-65
附录  65-72
致谢  72

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害 > 稻瘟病
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